Marcador genéticamente relacionado con la resistencia a tobamovirus en el pepino y su utilización.

Utilización de un marcador molecular para la identificación de un locus genético en un genoma de la planta de pepino que dota de una resistencia contra tobamovirus,

en el que dicho locus genético que dota de una resistencia contra tobamovirus se caracteriza por un fragmento de amplificación de ácido nucleico de 246 pb utilizando los cebadores SEQ. ID. nº 1 y SEQ. ID. nº 2 del polimorfismo molecular de longitud de fragmentos ampliados (AFLP) en un ensayo del polimorfismo molecular con longitud fragmento ampliado (AFLP).

Marcador genéticamente relacionado con la resistencia a tobamovirus en el pepino y su utilización La presente invención se refiere a un marcador molecular genéticamente relacionado con, y capaz de identificar, un locus genético en el genoma del pepino (Cucumis sativus L.) que dota de una resistencia general contra tobamovirus, y especialmente contra dos tobamovirus patógenos de importancia comercial, es decir, virus del mosaico moteado verde del pepino (por sus siglas en inglés, CGMMV) y el virus del mosaico moteado del pepino (por sus siglas en inglés, CFMMV) .

Las plantas de pepino (es decir, plantas de la especie botánica Cucumis sativus) pertenecen a la familia de las calabazas de las cucurbitáceas, que comprende también miembros de la familia como los melones y calabazas.

Los frutos comestibles de la planta se denominan generalmente pepinos. Los pepinos generalmente son frutos cilíndricos, de piel verde, que comprenden aproximadamente el 96% de agua. La planta de pepino Cucumis sativus L., que se cultiva desde hace mucho tiempo, es un importante cultivo hortícola en todo el mundo. Los pepinos se recogen normalmente en una fase inmadura y pueden utilizarse para la industria de encurtidos o el mercado de productos frescos.

Los tobamovirus que infectan las cucurbitáceas pueden ser clasificarse en dos subgrupos: subgrupo I que comprende las cepas y estirpess mencionados en la bibliografía como virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV, que comprende las cepas CV3, CV4, CGMMV-W, CGMMV-SH y CGMMV-Is) , y el subgrupo II de fruta que comprende el virus del mosaico moteado del fruto del pepino (CFMMV) , virus del mosaico moteado del kyuri verde (KGMMV) , y la cepa Yodo de CGMMV, que está estrechamente relacionado con KGMMV y puede considerar se una cepa de él (Antigus, 2001) .

El virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) es un virus con ARN del género tobamovirus que produce una enfermedad grave de las cucurbitáceas.

Las cepas de CGMMV se describieron por primera vez en el Reino Unido y Europa (Ainsworth, 1935) . El virus está presente en todos los tejidos (Hollings, 1975) y el virus se transmite rápidamente por las manos, ropas, cuchillos y otros equipos de los trabajadores y también es transportado por las semillas. El tratamiento térmico de las semillas se utiliza normalmente para controlar la contaminación vírica de las semillas (Kim, 2003) . CGMMV también puede propagarse a través del agua en la superficie (Drost, 1988) .

Los síntomas de amarilleamiento, moteado y rizado hacia abajo de las hojas se han descritoo aunque tal vez los más significativos son los informes del moteado y la distorsión moderada-grave del fruto. Dicho moteado y distorsión de la fruta podría volver incomercializables rápidamente los cultivos infectados.

El virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) es quizás el más extendido y reconocido de los tobamovirus que infectan los cultivos de pepino. CGMMV es un problema mundial en zonas de producción de pepino como Holanda, España (Celix, 1996) , Grecia (Varveri, 2002) y la India (Rashmi, 2005) . Las pérdidas de rendimiento pueden ser del 15% (Fletcher, 1962) . Se ha intentado encontrar resistencia en el pepino contra CGMMV (Hsiao, 1993) y se han encontrado algunas variedades asintomáticas de origen asiático (Kooistra, 1968) .

El CFMMV es otro miembro de la familia de los tobamovirus que causan daños económicos significativos a las plantas de pepino (Cucumis sativus L.) . Los síntomas de la infección por el virus del mosaico moteado del fruto del pepino (CFMMV) se reconocen generalmente por primera vez en las frutas y las hojas apicales en una etapa de crecimiento relativamente avanzada. Los síntomas foliares incluyen mosaico grave, necrosis de las venas y moteado amarillo. En algunos casos, plantas completamente desarrolladas presentan graves síntomas de marchitamiento que conducen a un colapso de la planta. La rápida propagación vírica dentro de los invernaderos puede conducir a pérdidas significativas de cosechas.

Grink'ko (2005) en la enfermedad del mosaico de los pepinos de invernadero describe que las investigaciones de invernaderos en el sur de Rusia pusieron de manifiesto la aparición de síntomas de clorosis en el 50% al 100% de los híbridos de pepino originados por tobamovirus del mosaico moteado verde del pepino. Para combatir la infección, se sugieren medidas combinadas que incluyen la utilización de cultivos e híbridos resistentes y una desinfección del suelo y del equipo.

Considerando los daños económicos producidos por tobamovirus en plantas de pepino (Cucumis sativus L.) y especialmente CGMMV y CFMMV, incluyendo sus variantes, es muy deseable proporcionar marcadores genéticos genéticamente relacionados con loci con resistencia genética contra los tobamovirus, o loci con particularidades cualitativas (por sus siglas en inglés, QTL) y capaces de identificarlos, y que transfieren esta resistencia a tobamovirus a variedades de Cucumis sativus L. económicamente importantes.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar dicho marcador genético.

Se da a conocer un procedimiento para proporcionar una planta de pepino (Cucumis sativus L.) resistente a tobamovirus que comprende:

(a) identificar un locus genético con resistencia a tobamovirus en una primera planta de pepino (Cucumis sativus L.) ;

(b) tranferir el locus genético con resistencia a tobamovirus identificado a una segunda planta de pepino (Cucumis sativus L.) ;

en la que el locus genético con resistencia a tobamovirus se caracteriza por la presencia de un fragmento de ampliación de ácido nucleico de 246 pb utilizando la SEQ. ID. nº 1 y la SEQ. ID. nº 2 de cebadores del polimorfismo molecular con longitud del fragmento ampliada (por sus siglas en inglés, AFLP) en un ensayo de polimorfismo molecular con longitud del fragmento ampliada (AFLP) .

Según la presente invención, la SEQ. ID. nº 1 del cebador comprende la secuencia de ácido nucleico 5-GAC TGC GTA CCA ATT CGT-3' y la SEQ. ID. nº 2 del cebador comprende la secuencia de ácido nucleico 5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3'.

El marcador del polimorfismo molecular con longitud de fragmento ampliada (AFLP) genéticamente relacionado con, y capaz de identificar, el presente locus genético de resistencia a tobamovirus también se denomina en la presente memoria marcador E22/M48-F-246 (fragmento del tamaño de la ampliación del AFLP con ácido nucleico: 246 pb, cuando se utilizan las SEQ. ID. nº 1 y nº 2 de los cebadores.

La primera planta de pepino (Cucumis sativus L.) puede ser cualquier planta de pepino (Cucumis sativus L.) que tiene un fenotipo resistente a tobamovirus, y especialmente CGMMV y CGMMV, conferida por el locus genético identificable por la presencia del fragmento de ampliación de ácido nucleico definido anteriormente (Marker E22/M48-F-246) .

La presencia del fragmento de ampliación de ácido nucleico, o del marcador molecular E22/M48-F-246 de AFLP, y por lo tanto la resistencia presente que dota de locus genético, puede establecerse usando cualquier técnica adecuada de Biología Molecular para el análisis de productos de ampliación de ácidos nucleicos tales como la electroforesis en gel, la hibridación, cromatografía de afinidad, la fluorescencia, etc.

En una realización particularmente preferida, los fragmentos se amplian y se identifican utilizando una técnica de ampliación y detección de ácido nucleico denominada en la técnica polimorfismo molecular con longitud del fragmento ampliado (AFLP, Zabeau, 1993, y Vos, 1995) .

El polimorfismo con longitud del fragmento ampliado (AFLP) es una técnica de la huella genética basada en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) , que se desarrolló al principio de la década de 1990 por Keygene. AFLP utiliza enzimas de restricción para cortar el ADN genómico, seguido de ligadura de adaptadores de doble cadena complementarios a los extremos de los fragmentos de restricción. Un subconjunto de los fragmentos de restricción se amplía entonces usando pares de cebadores complementarios al adaptador y fragmentos de enzimas de restricción. Los fragmentos se visualizan en geles de poliacrilamida desnaturalizantes ya sea por metodologías autorradiográfica o de fluorescencia.

Esto generalmente produce una multitud de fragmentos de ampliación de ácido nucleico de diferentes tamaños. Al comparar los fragmentos de ácido nucleico de ampliación obtenidos a partir de, por ejemplo, plantas sensibles y resistentes, discriminando fragmentos de ampliación de ácidos nucleicos pueden identificarse, denominado también marcadores, entre ambos fenotipos.

En el presente caso, un marcador AFLP específico,... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un marcador molecular para la identificación de un locus genético en un genoma de la planta de pepino que dota de una resistencia contra tobamovirus, en el que dicho locus genético que dota de una resistencia contra tobamovirus se caracteriza por un fragmento de amplificación de ácido nucleico de 246 pb utilizando los cebadores SEQ. ID. nº 1 y SEQ. ID. nº 2 del polimorfismo molecular de longitud de fragmentos ampliados (AFLP) en un ensayo del polimorfismo molecular con longitud fragmento ampliado (AFLP) .

2. Utilización según la reivindicación 1, en el que dicha resistencia al tobamovirus comprende la resistencia al virus del mosaico moteado verde del pepino (CGMMV) y al virus del mosaico moteado del fruto del pepino (CFMMV) .

3. Utilización según la reivindicación 1, en el que dicha resistencia al tobamovirus comprende la resistencia al 10 tobamovirus de uno o más subgrupos 1 y 2.