Placenta de mamífero post-parto, su uso y células madre de la misma.

Un biorreactor que comprende una placenta de mamífero aislada que ha sido exanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual,

en donde dicha placenta de mamífero comprende células de mamífero exógenas.

Placenta de mamífero post-parto, su uso y células madre de la misma

1. Introducción.

En el presente texto se describen métodos para exanguinar (desangrar) y perfundir una placenta después de la expulsión del útero, p. ej. después del alumbramiento. Se describen en el presente texto métodos para tratar y cultivar una placenta aislada para la propagación de células madre de tipo embrionario que se originan a partir de la placenta y fuentes exógenas. La presente invención se refiere además al uso de una placenta cultivada como biorreactor para producir materiales biológicos o células, tejidos y orgánulos de cultivo. En el presente texto se describe la recolección y propagación de células madre y en particular a la recolección de células madre de tipo embrionario y otras células madre multipotentes a partir de placentas. En el presente texto se describen células madre de tipo embrionario procedentes de una placenta post-parto.

2. Fundamento de la invención.

Hay un interés considerable en la identificación, el aislamiento y la generación de células madre humanas. Las células madre humanas son células precursoras totipotenciales o pluripotenciales capaces de generar una diversidad de linajes de células humanas maduras. Esta capacidad sirve como la base para la diferenciación y la especialización celulares necesarias para el desarrollo de los órganos y los tejidos.

El reciente éxito en el trasplante de dichas células madre ha proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o suplementar la médula ósea después de la mieloablación debida a una enfermedad, a la exposición a agentes químicos tóxicos y/o a la radiación. Además existe evidencia que demuestra que las células madre se pueden emplear para la repoblación de muchos tejidos, si es que no de todos, y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de células madre en la ingeniería de tejidos, el suministro de terapia génica y la terapia de células está también avanzando con rapidez.

Se han caracterizado muchos tipos diferentes de células madre de mamíferos. Por ejemplo, se conocen las células madre embrionarias, las células germinales embrionarias, las células madre adultas u otras células madre o células progenitoras comprometidas. Ciertas células madre no sólo han sido aisladas y caracterizadas, sino que también se han cultivado bajo condiciones que permiten hasta cierto punto la diferenciación. Sin embargo, sigue habiendo un problema básico en el que es casi imposible la obtención de suficientes cantidades y poblaciones de células madre humanas que sean capaces de diferenciarse en todos los demás tipos de células. El suministro de células madre es críticamente corto. Estas son importantes para el tratamiento de una amplia variedad de trastornos, incluyendo tumores malignos, errores de metabolismo innatos, hemoglobinopatías e inmunodeficiencias. Sería muy ventajoso tener una fuente más de células madre embrionarias.

La obtención de un número suficiente de células madre humanas ha sido problemática por varias razones. En primer lugar, el aislamiento de poblaciones de células madre que ocurre normalmente en tejidos adultos ha sido difícil y costoso desde el punto de vista técnico debido, en parte, a la muy limitada cantidad que se encuentra en la sangre o el tejido. En segundo lugar, la obtención de estas células a partir de embriones o tejido fetal, incluyendo abortos, ha generado problemas éticos y religiosos. La creencia generalizada de que el embrión y el feto humanos constituyen una vida independiente ha suscitado restricciones gubernamentales acerca del uso de tales fuentes para todos los fines, incluida la investigación médica. Las fuentes alternativas que no requieren el uso de células obtenidas a partir de tejido embrionario o fetal son por lo tanto esenciales para seguir avanzando en el uso clínico de células madre. Hay, sin embargo, pocas fuentes de células madre alternativas viables, en particular células madre humanas, y por lo tanto el suministro es limitado. Además, la recolección de células madre a partir de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para fines terapéuticos y de investigación es generalmente laborioso, implicando, por ejemplo, la recolección de células o tejidos de un sujeto o paciente donante, el cultivo y/o la propagación de células in vitro, la disección, etc.

Por ejemplo, Caplan et al. (pat. de EE.UU. n º 5.486.359 titulada "Human mesenchymal stem cells” (Células madre mesenquimales humanas) , expedida el 23 de enero de 1996) , describe composiciones de células madre mesenquimales humanas (hMSC) derivadas de la médula ósea que sirven como progenitoras para linajes de células mesenquimales. Caplan et al. describen que las hMSC se identifican por marcadores de superficie celular específicos que se identifican con anticuerpos monoclonales. Las composiciones de hMSC homogéneas se obtienen por selección positiva de células adherente de la médula o del periostio que están libres de marcadores asociados con células hematopoiéticas o bien con células mesenquimales diferenciadas. Estas poblaciones de células mesenquimales aisladas muestran características epitópicas asociadas con las células madre mesenquimales, tienen la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciación, y tienen la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales específicos cuando son inducidas in vitro o bien son puestas in vivo en el sitio del tejido dañado. El inconveniente de tales métodos, sin embargo, es que requieren la recolección de médula ósea o células del periostio de un donante, de la que subsiguientemente deben ser aisladas las MSC.

Hu et al. documento (WO 00/73421 titulado "Methods of isolation, cr y opreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells” (Métodos de aislamiento, criopreservación y uso terapéutico de las células epiteliales amnióticas humanas", publicado el 7 de diciembre de 2000) , describen células epiteliales amnióticas humanas derivadas de la placenta en el alumbramiento, que son aisladas, cultivadas, crioconservadas para su uso futuro, o inducidas a diferenciarse. De acuerdo con Hu et al., se recolecta una placenta inmediatamente después del parto y la membrana amniótica se separa del corion, por ejemplo mediante disección. Las células epiteliales amnióticas son aisladas de la membrana amniótica de acuerdo con técnicas estándar de aislamiento de células. Las células descritas pueden ser cultivadas en diversos medios, expandidas en cultivo, crioconservadas, o inducidas a diferenciarse. Hu et al. describen que las células epiteliales amnióticas son multipotenciales (y posiblemente pluripotenciales) , y pueden diferenciarse en tejidos epiteliales tales como el epitelio de superficie de la córnea o el epitelio vaginal. El inconveniente de tales métodos, sin embargo, es que son laboriosos y el rendimiento de células madre es muy bajo. Por ejemplo, para obtener un número suficiente de células madre con fines típicos terapéuticos o de investigación, primero se deben aislar las células epiteliales amnióticas del amnios mediante técnicas de disección y de separación celular, y después deben ser cultivadas y expandidas in vitro.

La sangre de cordón umbilical (sangre de cordón) es una fuente alternativa conocida de células madre progenitoras hematopoiéticas. Las células madre de sangre del cordón umbilical son crioconservadas de forma rutinaria para su uso en la reconstitución hematopoiética, un procedimiento terapéutico ampliamente utilizado en los trasplantes de médula ósea y otros trasplantes relacionados (véase, por ejemplo, Boyse et al., patente de EE.UU. nº 5.004.681, "Preservation of fetal and neonatal hematopoietin stem and progenitor cells of the blood”, Boyse et al., patente de EE.UU. nº 5.192.553, titulada "Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods o therapeutic use” (Aislamiento y conservación de células madre y progenitoras hematopoiéticas fetales y neonatales y métodos de uso terapéutico) , expedida el 9 de marzo de 1993) . Las técnicas convencionales para la recolección de sangre del cordón umbilical se basan en el uso de una aguja o una cánula, que se utiliza con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre del cordón umbilical desde la placenta (es decir, sangrado o exanguinación) (Boyse et al., patente de EE.UU. nº 5.192.553, expedida el 9 de marzo de 1993; Boyse et al, patente de EE.UU. nº 5.004.681, expedida el 2 de abril de 1991; Anderson, patente de EE.UU. nº 5.372.581,

titulada “Method and apparatus for placental blood collection” (Método y aparato para la recolección de sangre... [Seguir leyendo]

1. Un biorreactor que comprende una placenta de mamífero aislada que ha sido exanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual, en donde dicha placenta de mamífero comprende células de mamífero exógenas.

2. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde dichas células de mamífero exógenas se obtienen de un padre, hermano u otro consanguíneo del neonato asociado con la placenta.

3. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde las células de dicha placenta han sido expuestas a radiación sub-letal.

4. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde células de dicha placenta han sido expuestas a radiación letal.

5. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde dicha placenta de mamífero aislada ha sido perfundida o incubada durante al menos 48 horas.

6. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde dicha placenta aislada ha sido perfundida o incubada durante un tiempo entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 24 horas.

7. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde la solución usada para perfundir la placenta comprende una solución anticoagulante.

8. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde la solución usada para perfundir la placenta comprende un agente antimicrobiano.

9. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde las células de mamífero exógenas han sido modificadas por ingeniería genética.

10. El biorreactor según la reivindicación 1ª, en donde las células de mamífero son hibridomas.

11. El uso del biorreactor según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 10ª para cultivar dichas células de mamífero exógenas.

12. El uso según la reivindicación 11ª, en donde el biorreactor se usa para propagar dichas células de mamífero exógenas.

13. El uso según la reivindicación 11ª, en donde las células de mamífero exógenas son hibridomas y el biorreactor se usa para generar anticuerpos a partir de dichos hibridomas.

14. El uso según la reivindicación 11ª, en donde el biorreactor se usa para cribar moléculas terapéuticas que modulan una actividad de dichas células de mamífero exógenas.

15. El uso de un biorreactor que comprende una placenta de mamífero aislada, en donde dicha placenta de mamífero aislada ha sido exanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual, con el fin de propagar células madre placentarias, en donde dichas células madre placentarias:

(a) expresan antígenos reconocidos por los anticuerpos SH2, SH3 y SH4;

(b) no expresan antígenos del MHC Clase 2;

(c) son CD34- y CD38-;

(d) son OCT-4+ y ABC-p+;

(e) son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+; o

(f) son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.