Péptidos para la detección de anticuerpos de A. phagocytophila.

Un compuesto de materia que consiste en un polipeptido aislado como el mostrado en SEQ ID NO: 1.

Péptidos para la detección de anticuerpos de A. phagocytophila.

La invención se refiere a métodos y composiciones para la detección y cuantificación de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo A. phagocytophila. A. phagocytophila es conocida formalmente como Ehrlichia equi.

Antecedentes de la invención La ehrlichiosis granulocítica ocurre en mamíferos como los humanos, los caballos, los perros y los gatos y es causada por la infección de las células granulocítica con el agente de garrapatas A. phagocytophila (antiguamente conocida como Ehrlichia equi) . Síntomas frecuentemente reportados de ehrlichiosis granulocítica en los seres humanos son leucopenia y trombocitopenia. Signos clínicos más comunes en los perros y los caballos son fiebre y anexoria.

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELlSA) se utilizan con frecuencia como ayuda en el diagnóstico de enfermedades causadas por A. phagocytophila mediante la medición de la unión de anticuerpo a partir de la sangre de un paciente o en el suero de las células infectadas, lisados celulares o proteínas purificadas de ehrlichia. Sin embargo, estos ensayos están severamente limitados en utilidad debido a problemas de sensibilidad y especificidad relacionados directamente con la naturalez;a impura del antígeno utilizado en estas pruebas. Se necesitan reactivos altamente purificados para construir ensayos más precisos. Esta invención describe secuencias de péptidos sintéticos específicos derivados de A. phagocytophila que se pueden utilizar en lugar de las proteínas parcialmente purificadas, las células infectadas o lisados celulares.

Sumario de la invención Es un objeto de la invención es proporcionar métodos y composiciones para la detección y cuantificación de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos A. phagocytophila. Este y otros objetos de la invención se proporcionan por una o más de las realizaciones descritas a continuación.

Una realización de la invención proporciona una composición de materia que consiste esencialmente en un pOlipéptido aislado que se muestra en SEQ ID NO: 1. La composición puede comprender un vehículo. El polipéptido aislado de la composición puede ser conjugado con albúmina de suero bovino. La invención también comprende un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido aislado de la composición.

Otra realización de la invención proporciona un método para detectar anticuerpos especificos para A. phagocytophila. El método comprende poner en contacto un polipéptido que se muestra en SEQ ID NO: 1, o una combinación de dos polipéptidos SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 3 con una muestra de ensayo sospechosa de que comprende anticuerpos que son específicos para A. phagocytophila, en condiciones que permiten formar complejos polipéptidoslanticuerpos. El polipéptido puede estar unido a un sustrato y puede estar en una forma multimérica. La muestra de ensayo puede una muestra biológica obtenida de un mamífero, tal como un ser humano, gato, caballo o perro. Se detectan complejos polipéptidosl anticuerpos. La detección de complejos polipéptidoslanticuerpos es una indicación de que los anticuerpos especifico s para A. phagocytophila están presentes en la muestra de ensayo. Los complejos polipéptidosl anticuerpos pueden poner en contacto con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de sei'ial antes de la etapa de detección. Los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos. La cantidad de anticuerpo en una muestra de ensayo se puede determinar utilizando este método. El método puede comprender un ensayo seleccionado del grupo de ensayos que consisten en un ensayo de unión cromatográfico de flujo reversible, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, un radioinmunoensayo, un ensayo de hemaglutinación un ensayo de western blot, un inmunoensayo de polarización de fluorescencia y un ensayo de inmunofluorescencia indirecta.

Todavía otra forma de realización de la invención comprende un artículo de fabricación que comprende material de envasado y, contenidos dentro del material de envasado, un polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 1, o una combinación de dos polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3. El material de envasado puede comprender una etiqueta que indica que los uno o más polipéptidos se pueden utilizar para la identificación de infección por A. phagocytophila en un mamífero.

Aún otra realización de la invención proporciona un método para diagnosticar una infección por A. phagocytophila en un mamífero. El método comprende obtener una muestra biológica de un mamífero que se sospecha que tiene una infección por A. phagocytophila y en contacto un polipéptido mostrado en SEQ ID NO: 1, o una combinación de dos polipéptidos mostrados en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, con la muestra biológica en condiciones que permiten formar polipéptido/anticuerpo complejos. Se detectan los complejos polipéptido/anticuerpo. La detección de complejos polipéptido/anticuerpo es una indicación de que el mamífero tiene una infección por A. phagocytophila. Los complejos de polipéptidol anticuerpo pueden poner en contacto con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de sei'ial antes de la etapa de detección. El mamífero puede ser un ser humano, gato, caballo o perro.

Otra realización de la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo de Un polipéptido de A. phagocytophila, en el que dicho polipéptido es SEC ID NO: 1. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

Por consiguiente, la invención proporciona métodos y composICiones que se pueden utilizar para detectar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos A. phagocytophila con una mayor sensibilidad y especificidad.

Descripción detallada de la invención Las regiones inmunodominantes de una proteína de E. canis P30 previamente han sido identificados utilizando la tecnología de presentación en fagos. Véase la solicitud de patente US 09/765, 736 presentada el 18 de enero de 2001. Las secuencias identificadas presentaron una fuerte homología con secuencias de proteínas de membrana externa de varias cepas de Ehrlichia canis. Los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de las regiones homólogas de varias proteínas de membrana externa han sido sintetizados y utilizados en ensayos de diagnóstico para detectar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos contra E. canis.

A. phagocytophila y E. canis son diferentes especies de organismos relacionados que están clasificados en los diferentes serotipos del grupo Ehrlichia. Se examinaron secuencias de polipéptido de A. phagocytophila para identificar las regiones inmunodominantes. Fueron identificadas secuencias inmunodominantes derivadas de una proteína de membrana de A. phagocytophila, GE E8 msp-2, por comparación con polipéptidos inmunodominantes E. canis (Murphy et al., Infection and Immunity, . Vol 66 (8) , pp. 3711-3718 (1998». Las siguientes secuencias, que corresponden a los aminoácidos números 74 a 99, 62 a 92 y 120 a 139 de una proteína de membrana A. phagocytophila, se identificaron y se utilizaron como base para sintetizar dos péptidos sintéticos:

Péptido 1. Aminoácidos Nos. 74-99

KOGKSVKLESHKFOWNTPOPRIGFKO (SEO ID NO: 1)

Péptido 11. Aminoácidos No. 120-139

LEIGYERFKTKGIROSGSKE (SEO ID NO: 3)

Polipéptidos A. phagocytophila En una forma de realización de la invención, un polipéptido o fragmento del mismo es sustancialmente puro. Sustancialmente puro significa que un polipéptido de la invención está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas. Un polipéptido sustancialmente puro es al menOS 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% puro en peso seco. La pureza puede medirse por un método tal como cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC.

Los polipéptidos de la invención también pueden comprender variantes conservadoras de los polipéptidos mostrados en la SEO ID NO: 1. Una variante conservadora es un polipéptido que difiere de la SEO ID NO: 1, o un fragmento de la misma, sólo en sustituciones conservadoras, de tal manera que las propiedades antigénicas del polipéptido son sustancialmente la misma que la original de polipéptido. Las variantes conservadoras se pueden identificar generalmente mediante la modificación de una secuencia de polipéptido de la invención y la evaluación de la actividad antigénica del polipéptido modificado utilizando, por ejemplo, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , o un ensayo de western blot. Una variante, incluyendo una variante conservadora y una variante... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de materia que consiste en un polipéptido aislado como el mostrado en SEO ID NO: 1.

2. El compuesto de la reivindicación 1, que comprende además un vehículo.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el polipéptido aislado es conjugado con albúmina de suero bovino.

4. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido aislado de la reivindicación 1.

5. Un método de detección de anticuerpos específicos para A. phagocytophila que comprende: (a) contactar el polipéptido de SEO ID NO: 1 con una muestra de ensayo sospechosa de comprender anticuerpos específicos para A. phagocytophila, en condiciones que permiten formar complejos polipéptidos/anticuerpos; y (b) detectar complejos polipéptidos/anticuerpos, en el que la detección de complejos polipéptidos/anticuerpos es una indicación de que los anticuerpos específicos para A. phagocytophila están presentes en la muestra de ensayo.

6. El método de la reivindicación 5, que además comprende el contacto de los complejos del paso (a) con un indicador reactivo que comprende un compuesto generador de señal con anterioridad a la realización del paso

(b) .

7. El método de la reivindicación 5, en el que los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos.

8. El método de la reivindicación 5, en el que se determina la cantidad de anticuerpo en la muestra de ensayo.

9. El método de la reivindicación 5, en el que el polipéptido de SEO ID NO: 1 está unido a un sustrato.

10. El método de la reivindicación 5, en el que el polipéptido está en una forma multimérica.

11. El método de la reivindicación 5, en el que el polipéptido de SEO ID NO: 1 se encuentra presente en una proteína de fusión que comprende los polipéptidos de SEO ID NO: 1.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido está en una forma multimérica.

13. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra de ensayo comprende una muestra biológica obtenida de un mamífero.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el mamífero se selecciona del grupo compuesto por seres humanos, gatos, caballos y perros.

15. El método de la reivindicación 5, en el que el método comprende un ensayo seleccionado del grupo de ensayos consistentes en un ensayo de unión cromatográfico de flujo reversible, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, un radioinmunoensayo, un ensayo de hemaglutinación, un ensayo de western blot, un inmunoensayo de polarización de fluorescencia y un ensayo de inmunofluorescencia indirecta.

16. Un artículo de fabricación que comprende material de envasado y, contenido dentro del material de envasado, un polipéptido mostrado en SEO ID NO: 1.

17. El artículo de fabricación de la reivindicación 16, en el que el material de envasado comprende una etiqueta que indica que uno o más polipéptidos pueden ser utilizados para la identificación de infección por A. phagocytophila en un mamífero.

18. El artículo de fabricación de la reivindicación 17, en el que la etiqueta de una infección por A. phagocytophila comprende un método de detección de anticuerpos específicos para A. phagocytophila que comprende: (a) contactar el polipéptido de SEO ID NO: con una muestra de ensayo sospechosa de comprender anticuerpos específicos para A. phagocytophi/a, en condiciones que permiten formar complejos polipéptidos/anticuerpos; y (b) detectar complejos polipéptidosl anticuerpos, en que la detección de complejos polipéptidos/anticuerpos es una indicación de que está presente una infección por A. phagocytophi/a.

19. Un método in vitro de diagnóstico de una infección por A. phagocytophila en un mamífero que comprende: (a) preparar una muestra biológica obtenida de un mamífero sospechoso de tener una infección por A. phagocytophila; (b) contactar el polipéptido de SEO ID NO: 1 con la muestra biológica de (a) en condiciones que permitan formar complejos polipéptidos/anticuerpos; y (c) detectar complejos polipéptidoslanticuerpos; en que la detección de complejos polipéptidos/anticuerpos es una indicación de que el mamífero tiene una infección por A. phagocytophila.

20. El método de la reivindicación 19, que además comprende poner en contacto los complejos polipéptidosl anticuerpos del paso (b) con un indicador reactivo que comprende un compuesto generador de senal que genera una senal mesurable con anterioridad a la realización del paso (c) .

21. El método de la reivindicación 19, en el que el mamífero se selecciona del grupo compuesto por seres humanos, gatos, caballos y perros.

22. Un anticuerpo que se une específicamente a, por lo menos, un epítopo de un polipéptido de A. phagocytophila, en el que dicho polipéptido es SEO ID NO: 1.

23. El anticuerpo de la reivindicación 22, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoc\onal.

24. Un método de detección de anticuerpos específicos para A. phagocyfophila que comprende: (a) contactar una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos específicos para A. phagocytophila con el polipéptido de SEO ID NO: 3 y el polipéptido de SEO ID NO: 1, en el que el contacto se realiza en condiciones que permiten formar complejos polipéptidos/anticuerpos; y (b) detectar complejos polipéptidos/anticuerpos, en que I a detección de complejos polipéptidosl anticuerpos es una indicación de que anticuerpos específicos para A. phagocytophila están presentes en la muestra de ensayo.

25. El método de la reivindicación 24, que además comprende poner en contacto los complejos del paso (a) con un indicador reactivo que comprende un compuesto generador de senal con anterioridad a la realización del paso (b) .

26. El método de la reivindicación 24, en el que los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos.

27. El método de la reivindicación 24, en el que se determina la cantidad de anticuerpo en la muestra de ensayo.

28. El método de la reivindicación 24, en el que el polipéptido está en una forma multimérica.

29. El método de la reivindicación 24, en el que el polipéptido de SEO ID NO: 3 y el polipéptido de SEO ID NO: 1 es una proteína de fusión que comprende SEO ID NO: 3 y SEO ID NO: 1.

30. El método de la reivindicación 29, en el que al menos uno de los polipéptidos de la proteína de fusión está en una forma multimérica.

31. Una variante conservadora de un polipéptido mostrado en SEO ID NO: 1.