PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE MATERIALES MULTIFUNCIONALIZADOS.

Procedimiento de obtención de materiales multifuncionalizados.

La presente invención describe un procedimiento de obtención de materiales multifuncionales que comprende las etapas de: a) activación química de grupos funcionales presentes en un material base micro o nanoparticulado; b) reacción de sustitución nucleófila entre al menos un grupo amino, carboxilo o tiol terminal de una cadena de PNA o ADN tipo A y al menos un grupo funcional activado del material base obtenido en la etapa (a); c) conjugación a una biomolécula mediante activación química de grupos funcionales de una cadena de PNA/ADN tipo B, complementaria a la cadena PNA/ADN tipo A,; y d) hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, que están unidas al material base según la etapa b) y las cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas biomoléculas, según la etapa c) mediante reconocimiento molecular PNA-PNA o PNA-ADN.

Procedimiento de obtención de materiales multifuncionalizados La presente invención describe un procedimiento de multifuncionalización de materiales micro o nanoestructurados a los que se han anclado hebras de PNA o ADN sobre las que se hibridan mediante reconocimiento molecular, PNA-PNA o PNA-ADN, que a su vez están conjugadas con moléculas activas o bioactivas. La presente invención también se refiere a los materiales multifuncionales obtenidos por este procedimiento y a sus posibles aplicaciones biotecnológicas y biomédicas.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Un área de investigación que puede revolucionar el ámbito de los materiales sintéticos, es el campo de los materiales multifuncionales. Hoy en día, se requieren materiales multifuncionales con unas funciones adaptables y un diseño a la carta; es decir lo que se desea principalmente, es un diseño inteligente de estos materiales. Una de las áreas donde este tipo de materiales tienen un gran potencial, no sólo por el impacto económico que supone, sino además por su impacto social, es el campo de la aplicación de estos materiales multifuncionales en biotecnología y medicina.

El desarrollo de nuevos sistemas multifuncionales micro y nanoestructurados está alcanzando un gran interés para su utilización en aplicaciones biotecnológicas (bioprocesos enzimáticos, biorremediación, etc) y biomédicas (diagnóstico, imagen, terapia molecular, etc) . Se prevé que todos estos dispositivos tengan una gran utilidad en procesos de identificación temprana de enfermedades, en la ablación de tumores mediante hipertermia, en el transporte y liberación de fármacos o en la regeneración celular dentro de un organismo.

Si bien han sido publicadas varias aproximaciones R. Ojeda, J.L. de Paz, A.G. Barrientos, M. Martin-Lomas, S. Penades, Carb. Res. 342 (2007) 448-459 para la obtención de materiales multifuncionales, ninguno de estos protocolos puede ser aplicado de forma universal a todo tipo de material. La principal limitación para el desarrollo de una estrategia universal de multifuncionalización radica en las grandes diferencias existentes entre la gran variedad actual de materiales micro y nanoestructurados en cuanto a: tamaño, área superficial, densidad de grupos reactivos, forma, estabilidad coloidal, etc. Por ejemplo, en el caso particular de los materiales nanoestructurados, su multifuncionalización es una tarea para nada trivial, dado que por lo general involucra varias etapas, durante las cuales es indispensable que los mismos se mantengan estables en suspensión. Debido a su tamaño nanométrico, la estabilidad coloidal de estos materiales depende de un delicado balance entre fuerzas de atracción (van der Waals y/o magnéticas) y de repulsión (electrostáticas y/o estéricas) . Es así que pequeños cambios en el pH o la fuerza iónica del medio puede llevar a su rápida agregación, lo cual imposibilita la funcionalización de los mismos de forma escalable y reproducible. Dado que este balance de fuerzas es muy distinto para cada tipo de nanopartícula (magnéticas, metálicas, quantum dots, poliméricas, de sílica, de materiales biomiméticos, etc) o material nanoestructurado (nanotubos de carbono, silicio, etc) , no existe hasta el momento un protocolo universal de multifuncionalización. Hoy en día, es por lo tanto necesario optimizar distintas estrategias para cada caso en particular.

Otra dificultad añadida que se debe tener en cuenta a la hora de diseñar un protocolo de biofuncionalización de materiales, es que debe conservarse la orientación adecuada de las biomoléculas sobre la superficie de los mismos para que conserven su actividad biológica. Si esto no es así, la sensibilidad de un biosensor o la eficacia del material funcionalizado pueden verse comprometidas. Existen múltiples opciones de biomoléculas a unir para proveer de especificidad y bioactividad el material a funcionalizar: carbohidratos, aptámeros, péptidos, enzimas, receptores proteicos, anticuerpos, etc. Las grandes diferencias estructurales entre ellas hacen que sea imposible contar con una única estrategia que asegure la unión orientada de cualquier tipo de biomolécula. Es así que hoy en día para cada biomolécula, es necesario optimizar un protocolo de unión diferente.

Por último, los grupos funcionales del material no utilizados para anclar biomoléculas deben ser enmascarados (inertización de la superficie) para evitar así la adsorción inespecífica de proteínas. Una inertización no adecuada del material puede afectar a los límites de sensibilidad alcanzados en diagnosis. A su vez, si el material va a ser utilizado en terapia, inyectado por vía intravenosa, la adsorción inespecífica de proteínas plasmáticas haría que fuera reconocido por células del sistema fagocítico mononuclear y por lo tanto eliminado del torrente sanguíneo antes que cumpla la función terapéutica para la cual fue diseñado.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una estrategia de funcionalización la cual permite generar una plataforma para la incorporación en un único paso de diferentes moléculas con diferentes funcionalidades (marcadores tumorales, fármacos, marcadores fluorescentes, enzimas, toxinas, péptidos de internalización celular, anticuerpos, minianticuerpos, aptámeros, carbohidratos, receptores proteicos, etc) sobre un material micro o nanoparticulado.

La multifuncionalización comprende la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o ácido desoxirribonucleico (DNA) de tipo A, unidos previamente mediante enlace covalente a la superficie de un material micro o nanoparticulado, con otras secuencias complementarias de PNA o ADN de tipo B. Las cadenas complementarias están unidas a las biomoléculas de interés. La complementariedad de ambas cadenas (PNA_A o ADN_A con PNA_B o ES 2 397 909 Al

ADN_B) a través del reconocimiento molecular PNA-PNA o PNA-ADN, origina la conjugación de las moléculas bioactivas a la superficie de las micro o nanopartículas, en un proceso al que se ha denominado NIT-zipper (Figura 1) .

Las ventajas del procedimiento de la presente invención para funcionalizar micro o nanopartículas son las siguientes:

1. La estrategia propuesta permite generar partículas multifuncionales independizándose de las grandes diferencias existentes entre la gran variedad actual de materiales micro y nanoestructurados en cuanto a tamaño, área superficial, densidad de grupos reactivos, forma, estabilidad coloidal, etc.

2. Además de permitir independizarse de la heterogeneidad en cuanto al material a funcionalizar también permite independizarse de buscar la estrategia más adecuada para unir de forma activa cada una de las biomoléculas de interés. Independientemente del tipo de biomolécula la presente invención asegura la unión de varias biomoléculas de forma activa y en un único paso.

3. Si bien la estrategia propuesta puede llevarse acabo utilizando cadenas complementarias de ADN, el hecho de utilizar cadenas de PNA presenta varias ventajas:

-Dada la estructura de su esqueleto peptidomimético artificial, el PNA no es sensible a la acción de enzimas biodegradadoras naturales como DNasas, RNasas o proteasas, por lo que su estabilidad biológica es mucho mayor que la del ADN.

-El esqueleto de la molécula de PNA no contiene grupos fosfato y por lo tanto la unión entre hebras PNA/PNA y PNA/ADN es mucho más fuerte que entre hebras ADN/ADN dado que no existe repulsión electrostática. Esto tiene como consecuencia que para una misma secuencia nucleotídica la Tm sea mucho mayor en el caso de una doble hélice PNA/PNA o PNA/ADN que ADN/ADN. Por lo que secuencias más cortas de PNA permiten tener doble hebras más resistentes a la deshibridación con la temperatura. Finalmente, la insensibilidad del PNA a las variaciones de pH o de fuerza iónica hacen que posea también mucha mayor estabilidad química y permite que la estrategia propuesta pueda ser utilizada para funcionalizar nanopartículas que van a ser usadas en medios con composición compleja (sangre, suero, orina, saliva, lisados celulares, medios con alta salinidad

o pHs extremos, etc) .

-Por último la eficiencia de hibridación es mucho mayor cuando se utilizan hebras de PNA que de ADN (F Xu, A

M. Pellino, W Knoll, Thin Solid Films 516 (2008) 8634–8639) . La eficiencia y la cinética de hibridación de dos hebras de ADN en solución no sólo depende de la complementariedad de las secuencias sino también de la fuerza iónica del tampón, la temperatura, el pH, el largo de la secuencia, la relación entre el número de G-C (guaninas-citosina) y A-T (adeninas-timinas) , etc. En el caso de que una de las secuencias esté inmovilizada se suman a los... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de materiales multifuncionales que comprende las siguientes etapas:

a. activación química de grupos funcionales presentes en un material base micro o nanoestructurado;

b. reacción de sustitución nucleófila entre al menos un grupo amino o carboxilo terminal de una cadena de PNA tipo A o un grupo amino o tiol de una cadena de ADN tipo A y al menos un grupo funcional activado del material base obtenido en la etapa (a) ;

c. conjugación de una cadena de PNA/ADN tipo B, complementaria a la cadena PNA/ADN tipo A, a una biomolécula mediante activación química de grupos funcionales; y

d. hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, que están unidas al material base según la etapa b) y las cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas biomoléculas, según la etapa c) mediante el reconocimiento molecular PNA-PNA o PNA-ADN.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde los grupos funcionales a activar, presentes en el material base micro o nanoparticulado se seleccionan entre grupos –OH, -COOH, -CHO, -NH2, -SH, azidas o alquinos.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la activación de los grupos funcionales se lleva a cabo mediante un reactivo seleccionado entre carbodiimida, glutaraldehído, espaciadores bifuncionales, bromuro de cianógeno, epóxidos, N-hidroxisuccinimida, sulfo-N- hidroxisuccinimida.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, donde el reactivo se selecciona entre EDC, DCC, DIC, NHS, Sulfo-NHS, HATU, CDI o cualquiera de sus combinaciones.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, donde el reactivo es una combinación de NHS y EDC.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el material base es de tipo microparticulado.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde el material base de tipo microparticulado se seleccionan entre polímeros orgánicos naturales, polímeros orgánicos sintéticos, soportes inorgánicos y palancas de silicio.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde los polímeros orgánicos naturales se seleccionan del grupo formado por polisacáridos y proteínas fibrosas.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, donde los polímeros orgánicos sintéticos se seleccionan del grupo formado por poliolefinas y polímeros acrílicos.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, donde los soportes inorgánicos se seleccionan del grupo formado por soportes inorgánicos naturales y sintéticos.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el material base de tipo microparticulado tiene un tamaño de diámetro medio de entre 0, 1 e 700 μm.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde el material base de tipo microparticulado tiene un tamaño de diámetro medio de entre 0, 1 e 100 μm.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el material base es de tipo nanoestructurado.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde el material base nanoestructurado se selecciona entre nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de carbono, nanopartículas de oro-citrato, nanopartículas de óxidos de metales, nanopartículas superparamagnéticas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas de silicio, nanopartículas poliméricas, nanotubos de carbono, nanohilos de silicio y polisacáridos, nanopartículas de paladio, dendrímeros, nanopartículas de platino, nanocristales semiconductores, liposomas o cualquiera de sus combinaciones.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, donde el material base nanoparticulado tiene un tamaño de diámetro medio de entre entre 2 y 100 nm.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde el material base nanoestructurado está recubierto por una cubierta orgánica seleccionada entre citrato, aminoácidos naturales y no naturales, polietilenglicoles con grupos terminales amino, tiol hidroxilo o azida, polímeros o polisacáridos y sílica.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, donde la cubierta orgánica es un polímero.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, donde el polímero es el poli (anhídrido maleico-alt-1-octadeceno) .

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde las biomoléculas que se conjugan con las cadenas PNA o ADN tipo B, se seleccionan entre moléculas de reconocimiento biológico, agentes terapéuticos, profármacos, trazadores, péptidos de internalización celular y agentes bloqueantes.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, donde las moléculas de reconocimiento biológico se seleccionan entre vitaminas, hormonas o péptidos con actividad biológica, dominios extracelulares de receptores de membrana o moléculas de adhesión celular, toxinas, lectinas, enzimas, anticuerpos, minianticuerpos y aptámeros.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, donde los agentes terapéuticos se seleccionan entre fármacos hidrofóbicos, fármacos hidrofílicos, toxinas y radioisótopos.

22. Procedimiento según la reivindicación 19, donde los trazadores se seleccionan entre marcadores fluorescentes, agentes de contraste de resonancia magnética y radioisótopos.

23. Procedimiento según la reivindicación 19, donde los péptidos de internalización celular se seleccionan entre aquellos que tienen menos de 30 aminoácidos y son anfifílicos o con carga neta positiva.

24. Procedimiento según la reivindicación 19, donde los agentes bloqueantes se seleccionan entre polietilenglicoles y azúcares.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde en la etapa d) , la hibridación de las cadenas PNA/ADN tipo A, que están unidas al material base y las cadenas de PNA/ADN tipo B que tienen unidas biomoléculas, se lleva a cabo a temperaturas inferiores a la temperatura de fusión (Tm) de dichas cadenas mediante el reconocimiento molecular PNA-PNA o PNA-ADN.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, donde las temperaturas de fusión están dentro del intervalo de 25 a 80ºC.

27. Material funcionalizado obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

28. Uso del material funcionalizado de la reivindicación 27, para la detección de biomoléculas in vitro.

29. Uso según la reivindicación 28, como biochip, biosensor en formato soluble o anclado a una superficie, sistemas de separación basados en partículas magnéticas, sistemas de separación basados en partículas de metales nobles, columnas de purificación, microarrays o agentes de contraste basados en nanopartículas magnéticas.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29, donde las biomoléculas son proteínas, vitaminas, péptidos o ácidos nucleicos.

31. Uso del material funcionalizado de la reivindicación 27, para la elaboración de un medicamento.

32. Uso según la reivindicación 31, donde el medicamento es para la liberación dirigida de fármacos.

33. Uso según la reivindicación 32, donde el fármaco es un radio isótopo seleccionado entre iodo-125, paladio-103, oro198, 99mTc, Ga-68 ó Cu-64 o un citotóxico.

34. Uso según la reivindicación 33, donde el citotóxico es la doxorrubicina.

35. Uso del material funcionalizado de la reivindicación 27, como catalizador industrial en procesos de química fina y farmacéutica, biocombustibles, química de alimentos o química analítica.

36. Composición farmacéutica o veterinaria que comprende el material funcionalizado de la reivindicación 27.

ES 2 397 909 Al

ES 2 397 909 Al

FIG. 1