Moléculas de ácido nucleico que codifican alternano sacarasas truncadas.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa,

en la que la molécula de ácido nucleico está seleccionada de entre

a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia desde el nucleótido de la posición 118 hasta el nucleótidode la posición 3945, inclusive, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO3,

b) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos el70 % de identidad con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición1315, inclusive, de la SEQ ID NO 2, en la que dicha proteína tiene el mismo número de aminoácidos que laproteína con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1315,inclusive, de la SEQ ID NO 2,

c) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia de a),donde dicha secuencia tiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de a),

d) una moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos, como consecuencia de la degeneracióndel código genético, se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico de a), b) o c),

e) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos es complementaria a la secuencia delongitud completa de una de las moléculas de ácido nucleico de a), b), c) o d), en la que la secuenciacomplementaria tiene el mismo número de nucleótidos que las moléculas de ácido nucleico de a), b), c) o d).

Moléculas de ácido nucleico que codifican alternano sacarasas truncadas La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una alternano sacarasa truncada. La invención se refiere además a alternano sacarasas truncadas, a vectores, a células huésped y a células vegetales transformadas con las moléculas de ácido nucleico descritas y a plantas que comprenden estas células. La presente invención se refiere además a polímeros de alternano novedosos con propiedades ventajosas y a procedimientos para su producción.

El alternano es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa. Las unidades de glucosa están unidas entre sí por enlaces α-1, 3 y α-1, 6-glucosídicos, con estos dos tipos de enlace alternándose de forma predominante (Miasaki et al., Carbo. Res., 84:273-285 (1980) ) . Además, el alternano puede comprender ramificaciones (Seymour et al., Carbohydrate Research 74, (1979) ; 41-62) . El alternano nativo tiene un peso molecular medio Pm de 106-107 (documento WO 03/010177) .

Debido a sus propiedades físicoquímicas, se han analizado posibles usos del alternano, no sólo en la industria farmacéutica, por ejemplo como excipiente para principios activos en medicamentos, sino también como aditivo en la industria textil, cosmética y alimentaria (Lopez-Munguia et al., Enzyme Microb. Technol. 15, (1993) , 77-85; Leathers et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, (1997) , 278-283) . Otro posible uso es como sustituto de la goma arábiga (Cote, Carbohydate Polymers 19, (1992) , 249-252) .

El alternano se puede producir enzimáticamente usando enzimas con la actividad biológica de las alternano sacarasas. Las alternano sacarasas pertenecen al grupo de las glucosil transferasas que, partiendo de la sacarosa, pueden catalizar la formación de glucano y fructosa. Por lo general, las cepas naturales también producirán dextrano además de alternano. La producción de alternano sacarasa a partir de las cepas naturales supone una desventaja porque no se ha podido obtener la enzima en su forma pura, a pesar de los intentos de realizar complicados procedimientos de purificación; véase, por ejemplo, la descripción general de la introducción del documento WO 00/4772.

En el pasado se han realizado gran cantidad de intentos para proporcionar alternano sacarasa ultrapura por medio de rutas alternativas.

El documento WO 00/47727 describe moléculas de ácido nucleico que codifican una alternano sacarasa. Además, el documento WO 00/47727 se refiere a vectores, a células huésped y a células vegetales transformadas con las moléculas de ácido nucleico descritas y a plantas que comprenden estas células. Con ayuda de las moléculas de ácido nucleico del documento WO 00/47727, se pueden generar células huésped que producen proteína alternano sacarasa recombinante de gran pureza y/o en cantidades suficientes y generar plantas modificadas genéticamente con una actividad de estas enzimas, de modo que se forma alternano en la planta.

La solicitud de patente US20060127328A1 describe secuencias de ácidos nucleicos de alternano sacarasas truncadas o mutadas y vectores y células huésped transformadas. Se obtienen alternano sacarasas truncadas ultrapuras que mantienen su actividad catalítica. Además, se reivindica que las alternano sacarasas truncadas se expresan mejor y se degradan con menos rapidez.

A la vista de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar alternano sacarasas con propiedades aún mejores.

En particular, era un objeto de la invención proporcionar moléculas de ácido nucleico que se expresen particularmente bien en células vegetales con el fin de lograr una producción eficaz de alternano sacarasa en plantas.

Otro objeto era proporcionar una alternano sacarasa que provoque una producción de alternano en una planta transgénica con rendimiento alto.

Además, era un objeto de la invención proporcionar una alternano sacarasa con ayuda de la cual se pueda preparar un alternano con propiedades particularmente ventajosas.

Estos objetivos se logran proporcionando las formas de uso que se caracterizan en las reivindicaciones de la patente.

La presente memoria descriptiva se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa, donde la molécula de ácido nucleico se selecciona de entre a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia desde el nucleótido de la posición 118 hasta, e incluido, el nucleótido de la posición 4140, inclusive, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 3,

b) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos el

%, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % y lo más preferentemente al menos el 98 % de identidad con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1380, inclusive, de la SEQ ID NO 2,

c) una molécula de ácido nucleico con una secuencia desde el nucleótido de la posición 118 hasta el nucleótido de la posición 3945, inclusive, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 3,

d) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % y lo más preferentemente al menos el 98 % de identidad con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1315, inclusive, de la SEQ ID NO 2,

e) una molécula de ácido nucleico con una secuencia desde el nucleótido de la posición 118 hasta el nucleótido de la posición 4518, inclusive, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 3,

f) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % y lo más preferentemente al menos el 98 % de identidad con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1506, inclusive, de la SEQ ID NO 2,

g) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia tenga al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % y lo más preferentemente al menos el 98 % de identidad con la secuencia de a) , c) o e) , donde dicha secuencia tiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de a) , c) o e) ,

h) una moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos, como consecuencia de la degeneración del código genético, se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico de a) , b) , c) , d) , e) , f) o g) ,

i) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos es complementaria a la secuencia de longitud completa de una de las moléculas de ácido nucleico de a) , b) , c) , d) , e) , f) , g) o h) , donde la secuencia complementaria tiene el mismo número de nucleótidos que las moléculas de ácido nucleico de a) , b) , c) , d) , e) , f) , g) o h) .

La presente invención tiene, en particular, las siguientes ventajas:

Con ayuda de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, se pueden preparar proteínas con la actividad enzimática de una alternano sacarasa que, en comparación con la alternano sacarasa de longitud completa (por ejemplo, de origen natural) , tienen una secuencia de aminoácidos truncada.

En la presente invención, "alternano sacarasa de longitud completa" se refiere a la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 40 al 2057 de la SEQ ID NO 2. La alternano sacarasa de longitud completa de acuerdo con la definición anterior difiere de la alternano sacarasa descrita en la literatura (por ejemplo, en el documento US20060127328A1) por el hecho de que carece del péptido señal de los aminoácidos 1-39 de la SEQ ID NO 2.

Las proteínas de acuerdo con la invención con la actividad enzimática de una alternano sacarasa también se denominan en adelante en el presente documento "alternano sacarasa truncada" o "enzima truncada". El término "truncada" significa un truncamiento en el extremo N-y/o C-terminal de la secuencia de aminoácidos de una alternano sacarasa de longitud completa, o en el extremo 5’ o 3’ de la secuencia de ácidos nucleicos en cuestión. El truncamiento se puede llevar a cabo por medio de enzimas... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa, en la que la molécula de ácido nucleico está seleccionada de entre a) una molécula de ácido nucleico con una secuencia desde el nucleótido de la posición 118 hasta el nucleótido de la posición 3945, inclusive, de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 3,

b) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1315, inclusive, de la SEQ ID NO 2, en la que dicha proteína tiene el mismo número de aminoácidos que la proteína con la secuencia desde el aminoácido de la posición 40 hasta el aminoácido de la posición 1315, inclusive, de la SEQ ID NO 2,

c) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia de a) , donde dicha secuencia tiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de a) ,

d) una moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos, como consecuencia de la degeneración del código genético, se desvía de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico de a) , b) o c) ,

e) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia de ácidos nucleicos es complementaria a la secuencia de longitud completa de una de las moléculas de ácido nucleico de a) , b) , c) o d) , en la que la secuencia complementaria tiene el mismo número de nucleótidos que las moléculas de ácido nucleico de a) , b) , c) o d) .

2. La molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1, que tiene unido en su extremo 5’ un triplete de ácido nucleico ATG y en su extremo 3’ un triplete de ácido nucleico seleccionado de entre TAA, TAG y TGA.

3. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, en el que la molécula de ácido nucleico codifica una proteína como se define en la reivindicación 1b.

4. El vector como se reivindica en la reivindicación 3, que es un plásmido.

5. Una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, un vector como se reivindica en la reivindicación 3 o un plásmido como se reivindica en la reivindicación 4 o una célula huésped que deriva de dicha célula transformada y que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, o un vector como se reivindica en la reivindicación 3.

6. La célula huésped como se reivindica en la reivindicación 5, que es la célula de un microorganismo.

7. La célula huésped como se reivindica en la reivindicación 6, que es una célula de E. coli.

8. La célula huésped como se reivindica en la reivindicación 5, que es una célula vegetal, que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, o un vector como se reivindica en la reivindicación 3.

9. Una planta que comprende células vegetales como se reivindica en la reivindicación 8 que comprenden una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, o un vector como se reivindica en la reivindicación 3.

10. La planta como se reivindica en la reivindicación 9, que es una planta de almacenamiento de azúcar o almidón.

11. La planta como se reivindica en la reivindicación 9 o 10, que es patata, maíz, remolacha azucarera, sorgo azucarero o caña de azúcar.

12. Un material de propagación de una planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende células vegetales como se reivindica en la reivindicación 8.

13. Una parte de una planta cosechable obtenida a partir de una planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende células vegetales como se reivindica en la reivindicación 8.

14. Un procedimiento para generar una planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende las etapas siguientes:

a) introducir en una célula vegetal una molécula de ácido nucleico exógena como se reivindica en la reivindicación 1 o 2 o un vector como se reivindica en la reivindicación 3 o 4 por transformación,

b) regenerar una planta a partir de células vegetales obtenidas en la etapa a) , y

c) en caso apropiado, generar más plantas con ayuda de las plantas obtenidas en la etapa b) .

15. Una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa, proteína que está seleccionada de entre a) una proteína con una secuencia de aminoácidos que comienza en la región desde el aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 200 de la SEQ ID NO 2 y que termina en la región desde el aminoácido de la posición 1295 hasta el aminoácido de la posición 1345 de la SEQ ID NO 2,

b) una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la proteína de a) , en la que dicha proteína tiene el mismo número de aminoácidos que la proteína de a) .

16. La proteína como se reivindica en la reivindicación 15, que tiene una metionina unida a su extremo N.

17. Un procedimiento de producción de una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en el que

1) se transforma una célula huésped con a) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en el que la molécula de ácido nucleico se puede obtener a partir de una molécula de ácido nucleico con una secuencia mostrada en la SEQ ID NO 1 o 3, o b) un vector o plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en a) , 2) se cultiva la célula huésped en medio de cultivo y 3) se aísla la proteína a partir de las células cultivadas y/o el medio de cultivo.

18. Un procedimiento de producción de una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en el que 1) se transforma una célula vegetal con a) una molécula de ácido nucleico cuya secuencia codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína como se reivindica en la reivindicación 15 o 16, en el que la molécula de ácido nucleico se puede obtener a partir de una molécula de ácido nucleico con una secuencia mostrada en la SEQ ID NO 1 o 3, o b) un vector o plásmido que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en a) , 2) se regenera una planta a partir de las células vegetales obtenidas en la etapa 1) , 3) se expresa la proteína en la planta y posteriormente se extrae y se aísla.

19. Un procedimiento de producción de alternano con un promedio en peso del peso molecular Pm en el intervalo de desde 12 000 000 hasta 30 000 000 g/mol, en el que 1) se pone en contacto una solución que comprende sacarosa con una proteína con la actividad enzimática de una alternano sacarasa, y

2) se aísla alternano a partir de la solución, en el que la proteína es a) una proteína con una secuencia de aminoácidos que comienza en la región desde el aminoácido de la posición 1 hasta el aminoácido de la posición 200 de la SEQ ID NO 2 y que termina en la región desde el aminoácido de la posición 1295 hasta el aminoácido de la posición 1345 de la SEQ ID NO 2,

b) una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la proteína de a) , en la que dicha proteína tiene el mismo número de aminoácidos que la proteína de a) .

20. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 19, en el que proteína tiene una metionina unida a su extremo N.

21. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, en el que la solución que comprende sacarosa es una solución acuosa con una concentración en sacarosa de al menos el 15 % en base al peso de agua.

22. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en el que la etapa 1) del procedimiento se lleva a cabo a una temperatura d.

3. 45 °C.

23. Un procedimiento de producción de alternano, que comprende las etapas de extraer y aislar el alternano a partir de una célula vegetal como se reivindica en la reivindicación 8 de una planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9-11, a partir de material de propagación como se reivindica en la reivindicación 12 o a partir de partes de plantas cosechables como se reivindica en la reivindicación 13.