Moduladores de la regeneración neuronal.

Un método para identificar un antagonista de PirB/LILRB que comprende poner en contacto un agente candidatocon un complejo que comprende PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina,

o un fragmento de lamisma, y detectar la capacidad de dicho agente candidato para inhibir la interacción entre PirB/LILRB y dicha mielinao proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en la que el agente candidato se identifica como unantagonista si se inhibe la interacción.

Moduladores de la regeneración neuronal

Campo de la invención La presente invención se refiere en general al desarrollo neural y trastornos neurológicos. La invención se refiere específicamente a la identificación de nuevos moduladores del sistema inhibidor asociado a mielina y diversos usos de los moduladores así identificados.

Antecedentes de la invención Mielina y proteínas asociadas a mielina Se sabe que los axones de las neuronas del SNC de adultos tienen una capacidad muy limitada para regenerarse después de una lesión, mientras que los axones en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran rápidamente. La capacidad limitada de las neuronas del SNC para regenerarse es en parte una propiedad intrínseca de los axones del SNC, pero también se debe a un ambiente no permisible. La mielina del SNC, aunque no es la única fuente de señales inhibidoras para la extensión de neuritas, contiene numerosas moléculas inhibidoras que bloquean activamente el crecimiento axonal y de este modo constituye una barrera significativa a la regeneración. Se han identificado tres de dichas proteínas asociadas a mielina (MAP) : Nogo (también conocida como NogoA) es un miembro de la familia de proteínas Reticulón que tienen dos dominios transmembrana; la glicoproteína asociada a mielina (MAG) es una proteína transmembrana de la superfamilia de la Ig; y OMgp es una proteína con repeticiones ricas en leucina (LRR) con un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) . Chen et al., Nature 403: 434-39 (2000) ;

GrandPre et al., Nature 417: 439-444 (2000) ; Prinjha et al., Nature 403: 383-384 (2000) ; McKerracher et al, Neuron 13: 805-11 (1994) ; Wang et al, Nature 417: 941-4 (20020: Kottis et al J. Neurochem 82: 1566-9 (2002) ) . Se ha descrito una parte de NogoA, Nogo66, como un polipéptido extracelular de 66 aminoácidos que se encuentra en las tres isoformas de Nogo.

A pesar de sus diferentes estructurales, se ha mostrado que las tres proteínas inhibidoras (también Nogo66) se unen al mismo receptor anclado en GPI, llamado receptor de Nogo (NgR; también conocido como Receptor de Nogo 1 o NgR1) , y se ha propuesto que podría requerirse NgR para mediar en las acciones inhibidoras de Nogo, MAG y OMgp. Fournier et al., Nature 409: 341-346 (2001) . También se han identificado dos homólogos de NgR1 (NgR2 y NgR3) . Documento US 2005/0048520 A1 (Strittmatter et al.) , publicado el 3 de marzo de 2005. Dado que NgR es una proteína de superficie celular anclada a GPI, es poco probable que sea un transductor de señal directo (Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1205-1210 (2005) ) . Otros han sugerido que el receptor de neurotrofina p75NTR actúa como un correceptor para NgR y proporciona el resto transductor de señal en un complejo receptor (Wang et al., Nature 420: 74-78 (2002) ; Wong et al., Nat. Neurosci. 5: 1302-1308 (2002) ) .

Sin embargo, recientes estudios del complejo receptor NgR/p75NTR ha planteado interrogantes acerca del papel del NgR en el sistema inhibidor asociado a mielina. Zheng et al. han mostrado que la supresión genética de NgR no reduce la inhibición de neuritas in vitro ni promueve la regeneración del tracto corticoespinal (CST) in vivo. Zheng et al. (2005) , mencionado anteriormente. Coherentemente con estos resultados, otro estudio no consiguió detectar ninguna regeneración potenciada del CST en ratones mutantes para NgR. Kim et al., Neuron 44: 439- 451 (2004) .

Estos hallazgos contradicen la hipótesis de que el complejo receptor NgR/p75NTR representa el punto de convergencia clave para múltiples señales inhibidoras. La incapacidad de regeneración del CST en ratones mutantes para NgR contrasta con la regeneración del CST observada con animales de tipo silvestre tratados con un péptido antagonista de la interacción Nogo66/NgR (GrandPre et al. Nature 417: 5470551 (2002) y Li y Strittmatter, Nature 23: 4219- 4227 (2002) ) . Otro estudio ha mostrado que la expresión de un fragmento negativo dominante de NgR conduce a la regeneración potenciada de axones del nervio óptico en combinación con una lesión condicional. Ninguno de estos experimentos consiguió ensayar directamente la implicación de NgR, ya que ambos péptidos antagonistas tienen el potencial de interferir con otros ligandos/receptores inhibidores.

Estas inconsistencias con los resultados experimentales son una fuerte indicación de que NgR, o el complejo 55 receptor NgR/p75NTR, podrían desempeñar un papel limitado en la inhibición asociada a mielina de la regeneración del SNC, y otros componentes, tales como receptores adicionales o compañeros de unión, podrían participar en la transmisión de la señal inhibidora.

PirB y ortólogos humanos El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I se identificó originalmente como una región que codifica una familia de moléculas que son importantes para el sistema inmunitario. Recientes pruebas han indicado que las moléculas del MHC de clase I tienen funciones adicionales en el SNC en desarrollo y del adulto. Boulanger y Shatz, Nature Rev Neurosci. 5: 521-531 (2004) ; documento US 2003/0170690 (Shatz y Syken) , publicado el 11 de 65 septiembre de 2003. Se ha descubierto que muchos de los miembros del MHC de clase I y sus compañeros de unión se expresan en neuronas del SNC. Recientes estudios genéticos y moleculares se han centrado en las funciones fisiológicas del MHC de clase I del SNC, y los resultados iniciales sugieren que las moléculas del MHC de clase I podrían estar implicadas en plasticidad sináptica dependiente de actividad, un proceso durante el cual la fuerza de las conexiones sinápticas existentes aumenta o se reduce en respuesta a la actividad neuronal, seguido de alteraciones estructurales a largo plazo en los circuitos. Además, la región codificante del MHC de clase I también se ha ligado genéticamente a una amplia diversidad de trastornos con síntomas neurológicos, y se cree que las funciones anómalas de las moléculas del MHC de clase I contribuyen a la alteración del desarrollo y la plasticidad normales del cerebro.

Uno de los receptores del MHC de clase I conocidos en el ambiente inmunitario es PirB, un polipéptido murino que se describió por primera vez por Kubagawa et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 5261- 6 (1997) . El PirB de ratón tiene varios ortólogos humanos, que son miembros de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos (LILRB) , y también se denominan “transcritos de tipo inmunoglobulina” (ILT) . Los ortólogos humanos muestran homología significativa con la secuencia murina, en el siguiente orden de mayor a menor: LILRB3/ILT5, LILRB1/ILT2, LILRB5/ILT3, LILRB2/ILT4, y, al igual que PirB, son todos receptores inhibidores. LILRB3/ILT5 (NP_ 15 006855) y LILRB1/ILT2 (NP_ 006660) se describieron en primer lugar por Samaridis y Colonna, Eur. J. Immunol. 27 (3) : 660- 665 (1997) . LILRB5/ILT3 (NP_ 006831) se ha identificado por Borges et al., J. Immunol. 159 (11) : 51925196 (1997) . LILRB2/ILT4 (también conocido como MIR10) , se ha identificado por Colonna et al., J. Exp. Med. 186: 1809-18 (1997) . PirB y sus ortólogos humanos muestran un alto grado de variabilidad estructural. Las secuencias de diversas formas cortadas y empalmadas de forma alternativa están disponibles de EMBL/GenBank, incluyendo, por ejemplo, los siguientes números de referencia para ADNc de ILT4 humano: ILT4-c11 AF009634; ILT4-c117 AF11566; ILT4-c126 AF11565. Como se ha observado anteriormente, los polipéptidos de PirB/LILRB son receptores inhibidores del MHC de Clase I (MHCI) , y se conocen por su papel en la regulación de la activación de células inmunitarias (Kubagawa et al., mencionado anteriormente; Hayami et al., J. Biol. Chem. 272: 7320 (1997) ; Takai et al., Immunology 115: 433 (2005) ; Takai et al., Immunol. Rev. 181: 215 (2001) ; Nakamura et al. Nat. Immunol. 5: 623

(2004) ; Liang et al., Eur. J. Immunol. 32: 2418 (2002) ) .

Un reciente estudio de Syken et al. Science 313: 1795-800 (2006) ) indicó que PirB se expresa en subconjuntos de neuronas por todo el cerebro. En ratones mutantes sin PirB funcional, la plasticidad de dominancia ocular cortical (OD) se potencia significativamente a todas las edades, lo que sugiere función del PirB en la restricción de la plasticidad dependiente de actividad en el córtex visual.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente hallazgo de que PirB/LILRB son compañeros de unión para Nogo (Nogo66) y MAG, y que los antagonistas de PirB/LILRB y la actividad de PirB/LILRB reducida alteran significativamente la ruta inhibidora asociada a mielina, promoviendo de este modo la regeneración neuronal.

Sumario de la invención En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar un antagonista de... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un antagonista de PirB/LILRB que comprende poner en contacto un agente candidato con un complejo que comprende PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la 5 misma, y detectar la capacidad de dicho agente candidato para inhibir la interacción entre PirB/LILRB y dicha mielina o proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, en la que el agente candidato se identifica como un antagonista si se inhibe la interacción.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la interacción es unión o señalización celular, opcionalmente en el que dicha señalización celular da como resultado la inhibición de la extensión de los axones o de la regeneración neuronal.

3. El método de la reivindicación 1 en el que la proteína asociada a mielina se selecciona del grupo que consiste en Nogo, MAG y OMgp. 15

4. El método de la reivindicación 3 en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB1, LILRB2, LILRB3 y LILRB5, opcionalmente en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) , LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14) , LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10) , LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11) , LILRB1, variante de transcrito 3

(SEC ID Nº: 12) , LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13) , LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15) , LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16) , LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17) , LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18) y LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19) , adicionalmente opcionalmente en el que dicho PirB es LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) o LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14) .

5. El método de la reivindicación 3 en el que el complejo comprende además NgR.

6. El método de la reivindicación 1 en el que el agente candidato se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, ARN de interferencia cortos (ARNip) , moléculas orgánicas

pequeñas, polisacáridos y polinucleótidos, opcionalmente en el que el agente candidato es un anticuerpo o un ARN de interferencia corto (ARNip) .

7. El método de la reivindicación 6 en el que dicho anticuerpo se une específicamente a PirB/LILRB, opcionalmente en el que dicho anticuerpo se une específicamente a un LILRB2. 35

8. El método de la reivindicación 7 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno, en el que dicho fragmento de anticuerpo se secciona opcionalmente del grupo que consiste en fragmentos Fv, Fab, Fab’ y F (ab’) 2.

9. El método de la reivindicación 1 en el que al menos uno de dicho PirB/LILRB y dicha mielina o proteína asociada a mielina, o fragmento de la misma, se inmoviliza.

10. El método de la reivindicación 1 que es un ensayo basado en células, opcionalmente en el que dicho ensayo basado en células comprende cultivar células neuronales con dicha mielina o proteína asociada a mielina, o 45 fragmento de la misma, en presencia y ausencia de dicho agente candidato y determinar el cambio de la longitud de las neuritas, en el que dicho agente candidato se identifica como un antagonista cuando la longitud de la neurita es mayor en presencia de dicho agente candidato.

11. El método de la reivindicación 10 en el que dichas células neuronales son neuronas primarias o derivan de 50 células o líneas de células madre embrionarias no humanas (ES) , o en el que dichas células neuronales derivan de neuroblastoma, o se seleccionan del grupo que consiste en neuronas granulares cerebelares, neuronas de ganglios de las raíces dorsales y neuronas corticales.

12. Un método in vitro para potenciar la extensión de neuritas y/o promover el crecimiento, la reparación y/o la 55 regeneración neuronales, comprendiendo el método identificar un antagonista de PirB/LILRB de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y usar el antagonista identificado para potenciar la extensión de neuritas y/o promover el crecimiento, la reparación y/o la regeneración neuronales, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB.

13. Un antagonista de PirB/LILRB identificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11 para uso en un método para tratar lesión neural en un sujeto, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB.

14. Uso de un complejo de PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma, 65 para identificar un antagonista de PirB/LILRB.

15. Uso de un antagonista de PirB/LILRB en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurológico, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB e inhibe la interacción entre PirB/LILRB y mielina o una proteína asociad a mielina, o un fragmento de la misma.

16. Un antagonista de PirB/LILRB en el tratamiento de un trastorno neurológico, en el que el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a PirB/LILRB e inhibe la interacción entre PirB/LILRB y mielina o una proteína asociada a mielina, o un fragmento de la misma.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con la 10 reivindicación 16, en el que el tratamiento es curativo, profiláctico o preventivo.

18. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el trastorno neurológico se caracteriza por un nervio dañado físicamente o es una enfermedad neurodegenerativa.

19. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el tratamiento es la prevención de neurodegeneración.

20. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en

el que el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste en daño a los nervios periféricos provocado por lesión física o diabetes; daño físico al sistema nervioso central; daño cerebral asociado con ictus, neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , atrofia muscular progresiva, atrofia muscular heredada bulbar progresiva, síndromes de discos intervertebrales herniados, rotos y prolapsados, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de salida torácica, neuropatías periféricas, porfiria, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.

21. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en el que la interacción es unión o señalización celular, opcionalmente en el que dicha señalización celular da como 30 resultado la inhibición de la extensión de los axones o de la regeneración neuronal.

22. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en el que la proteína asociada a mielina se selecciona del grupo que consiste en Nogo, MAG y OMgp.

23. El uso o antagonista de PirB/LILRB para uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB1, LILRB2, LILRB3 y LILRB5, opcionalmente en el que dicho PirB/LILRB se selecciona del grupo que consiste en LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) , LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14) , LILRB1, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 10) , LILRB1, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 11) , LILRB1, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 12) , LILRB1, variante de transcrito 4 (SEC ID Nº: 13) ,

LILRB3, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 15) , LILRB3, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 16) , LILRB5, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 17) , LILRB5, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 18) y LILRB5, variante de transcrito 3 (SEC ID Nº: 19) , adicionalmente opcionalmente en el que dicho PirB es LILRB2, variante de transcrito 1 (SEC ID Nº: 2) o LILRB2, variante de transcrito 2 (SEC ID Nº: 14) .

FIG. 5

Secuencia de PirB (de ratón) (SEC ID Nº: 1)

Secuencia de LILRB2 (humana) (SEC ID Nº:2)

LILRB1, variante de transcrito 1:

FIGURA 9

LILRB 1, variante de transcrito 2:

FIGURA 10

LILRB1, variante de transcrito 3:

FIGURA 11

LILRBl, variante de transcrito 4:

FIGURA 12

LILRB2, variante de transcrito 2:

FIGURA 13

LILRB3, variante de transcrito 1:

FIGURA 14

LILRB3, variante de transcrito 2:

FIGURA 15

LILRB5, variante de transcrito 1:

FIGURA 16

LILRB5, variante de transcrito 2:

FIGURA 17

LILRB5, variante de transcrito 3:

FIGURA 18