Modelo in vitro de degeneración del sistema nervioso central y método de obtención del mismo.

Modelo in vitro de degeneración del sistema nervioso central y método de obtención del mismo.

La presente invención se refiere a un método para la obtención de un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del sistema nervioso central (SNC). Además, la presente invención se refiere a un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del SNC obtenible mediante dicho método y al uso de dicho modelo para el estudio de la hidrocefalia. Por último, la presente invención se refiere a un método de búsqueda de fármacos neuroprotectores que comprende el cultivo de dicho modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del SNC.

Modelo in vitro de degeneración del sistema nervioso central y método de obtención del mismo

La presente invención se refiere a un método para la obtención de un modelo in vitro de degeneración del sistema 5 nervioso central (SNC) , al modelo obtenible por dicho método, a su uso para el estudio de la hidrocefalia y a un método de búsqueda de fármacos neuroprotectores que comprende el cultivo de dicho modelo. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la Biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA 10

La formación de una cicatriz glial por astrocitos reactivos, supone uno de los principales impedimentos en la regeneración del SNC. El papel de los astrocitos en las lesiones y en la neurodegeneración está cuestionado hoy en día. Los astrocitos se activan en las lesiones y reclutan a otros para formar la cicatriz glial. Dicha cicatriz glial bloquea la regeneración neuronal y la revascularización, interfiriendo por tanto con la recuperación de la región 15 dañada. Por tanto, existe un debate sobre si la reacción astrocitaria tiene un papel beneficioso o perjudicial (Sofroniew 2005 Neuroscientist. 11:400-7) . La reacción astrocitaria puede tener efectos beneficiosos en las fases agudas de los traumas, donde limitaría las respuestas inflamatorias. Es por tanto necesario estudiar más a fondo dicha respuesta astrocitaria.

Por un lado, los modelos animales constituyen herramientas esenciales para el estudio de los daños moleculares y celulares y la neurodegeneración en el SNC. No obstante, son con frecuencia demasiado complejos para el aislamiento y control de variables específicas. Aunque reflejan bastante bien la realidad de las enfermedades, en comparación con los modelos in vitro, los modelos animales son más costosos y requieren más trabajo y tiempo.

Por otro lado, los estudios in vitro permiten evaluar los efectos terapéuticos sobre las células aisladas de su contexto habitual y de sus interacciones, lo cual aleja el modelo de la realidad y lo hace menos eficaz. En el caso de las reacciones astrocitarias, se emplean modelos en dos dimensiones (2D) en los que se induce a los astrocitos a formar una especie de cicatriz en la placa de cultivo (Yu et al 1993 J Neurosci Res, 34:295-303) , o se los cultiva sobre membranas (McKeon et al 1991 J Neurosci. 11 (11) :3398-411, ) , o alrededor de microelectrodos (Polikov 2006 30 Biomaterials. 27 (31) :5368-76) , entre otros. No obstante, en muchos modelos 2D los astrocitos se encuentran altamente reactivos, por lo que no son útiles para monitorizar la activación astrocitaria que ocurre en las enfermedades o daños del SNC.

Por tanto, mantener los astrocitos inactivos para después activarlos ha sido uno de los requerimientos que se han 35 buscado a la hora de diseñar modelos. Una de las estrategias seguidas para solventar este requerimiento ha consistido en cultivar los astrocitos en monocapa confluente y someterlos a un daño mecánico que provoque una discontinuidad y, de esa forma, inducir que se activen (Lanosa y Colombo 2007 In Vitro Cell Dev Biol Anim 43:186-95) . También se han diseñado modelos tridimensionales (3D) para poder investigar el comportamiento astrocitario en un estado fisiológico más relevante en su interrelación y con el entorno (East et al 2009 J Tissue Eng Regen Med, 40 3:634-46) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un modelo in vitro en tres 45 dimensiones (3D) de degeneración del SNC.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del SNC obtenible mediante el método del primer aspecto de la presente invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso del modelo del segundo aspecto de la invención para el estudio de la hidrocefalia.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método de búsqueda de fármacos neuroprotectores que comprende el cultivo del modelo del segundo aspecto de la presente invención. 55

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han diseñado un modelo in vitro a partir de explantes de paredes ventriculares. Este modelo emula una neurodegeneración periventricular como ocurre en la hidrocefalia congénita, donde 60 interviene una reacción astrocitaria. Al tratarse de un modelo in vitro en tres dimensiones (3D) , aporta las ventajas de poder estudiarlo de una forma controlada y manteniendo las interacciones celulares entre neuronas, glía, ependimocitos, células endoteliales, etc.

El modelo de la presente invención combina las ventajas de los modelos animales y de los modelos in vitro, y permite el estudio in vitro del tejido en el que diferentes tipos de células interactúan. Los cultivos de explantes ofrecen una disposición 3D, así como la posibilidad de mantener las interacciones celulares.

En el estudio de nichos neurogénicos se emplean explantes de la región ventricular que cubre el estriado. Esos 5 estudios se han llevado a cabo colocando los explantes sobre una matriz a partir de membrana basal (Matrigel) , mediante la cual se ensayan factores de crecimiento, sobre matrices de fibronectina y sobre colágeno.

La presente invención representa un modelo donde aparecen fenómenos neurodegenerativos neuronales y de la mielina asociados con reacciones astrocitarias y microgliales. La presente invención permite estudiar los efectos de 10 distintos procedimientos terapéuticos sobre las reacciones neurodegenerativas que incluyan reacciones astrocitarias.

El modelo de la presente invención es útil para el estudio terapéutico de la hidrocefalia congénita, pero además puede ser útil para otras enfermedades neurodegenerativas y daños al SNC. Además, permite evaluar la capacidad 15 neurorregenerativa de los nichos neurogénicos que contienen células madre.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la obtención de un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del SNC que comprende las siguientes etapas:

(a) la obtención de al menos un explante de tejido periventricular a partir de al menos una muestra aislada; y 20

(b) el cultivo del explante obtenido en la etapa (a) .

En la presente descripción, el término “degeneración” se refiere a la pérdida progresiva de la estructura o la función del sistema nervioso.

En la presente descripción, el término “explante” se refiere a una porción de tejido procedente de un sujeto. El tejido en este caso es tejido del SNC, más particularmente es tejido periventricular. En la presente descripción, el término “periventricular” se refiere a que rodea o circunda los ventrículos cerebrales. Dichos ventrículos son los dos ventrículos laterales, el tercer y el cuarto ventrículo, y son estructuras que contienen líquido cefalorraquídeo.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la degeneración del SNC comprende una neurodegeneración periventricular. Preferiblemente, la degeneración periventricular comprende una reacción astrocitaria. En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la degeneración del SNC comprende la formación de una cicatriz glial.

En la presente descripción, el término “reacción astrocitaria” se refiere a la reacción de las células del SNC denominadas astrocitos, también conocida como astrogliosis. Los astrocitos son células que reaccionan ante lesiones, ya sean físicas o químicas, al SNC. Dicha reacción ha sido ampliamente estudiada y caracterizada y es conocida por el experto en la materia. El término “cicatriz glial” se refiere a la estructura celular que se forma como consecuencia de la reacción astrocitaria. 40

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el explante periventricular es de los ventrículos laterales.

Los cuernos anteriores de los ventrículos laterales están separados por el septum, que va desde el cuerpo calloso 45 hasta el fórnix. Lateralmente hacia fuera, los ventrículos laterales están limitados por el estriado. En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el explante comprende la pared ventricular que cubre el septum o la pared ventricular que cubre el estriado. Preferiblemente, el explante comprende la pared ventricular que cubre el estriado.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la muestra aislada de la etapa (b) procede de un sujeto control o de un sujeto con hidrocefalia.

En la presente descripción, el término “sujeto control” se refiere a un sujeto sano o al menos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la obtención de un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del sistema nervioso central que comprende las siguientes etapas:

(a) la obtención de al menos un explante de tejido periventricular a partir de al menos una muestra aislada; y 5

(b) el cultivo del explante obtenido en la etapa (a) .

2. El método según la reivindicación 1, donde la degeneración del sistema nervioso central comprende una neurodegeneración periventricular.

3. El método según la reivindicación 2, donde la degeneración periventricular comprende una reacción astrocitaria.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la degeneración del sistema nervioso central comprende la formación de una cicatriz glial.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el explante periventricular es de los ventrículos laterales.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el explante comprende la pared ventricular que cubre el septum o la pared ventricular que cubre el estriado. 20

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el explante comprende la pared ventricular que cubre el estriado.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la muestra aislada de la etapa (b) procede de un 25 sujeto control o de un sujeto con hidrocefalia.

9. El método según la reivindicación 8, donde la muestra aislada de la etapa (b) procede de un sujeto control.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde el sujeto es un roedor. 30

11. El método según la reivindicación 10, donde el roedor es un ratón.

12. El método según la reivindicación 11, donde el ratón es un ratón mutante de la cepa hyh.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el explante tiene entre 0, 5 y 1, 5 mm de grosor.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el explante tiene un tamaño de entre 3.000 y 5.000 micrómetros cuadrados de superficie y 500 micrómetros de grosor. 40

15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el cultivo de la etapa (b) se lleva a cabo en flotación.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el cultivo de la etapa (b) se lleva a cabo en 45 ausencia de un recubrimiento o una matriz.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el cultivo de la etapa (b) se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende Neurobasal y el suplemento B27.

18. Un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del sistema nervioso central obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. El modelo según la reivindicación 18, caracterizado porque comprende al menos dos explantes.

20. El modelo según la reivindicación 18, caracterizado porque un explante procede de una muestra aislada de un sujeto control y otro explante procede de una muestra aislada de un sujeto con hidrocefalia.

21. El modelo según cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque un explante comprende la pared ventricular que cubre el septum y otro explante comprende la pared ventricular que cubre el estriado. 60

22. Uso del modelo según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 para el estudio de la hidrocefalia.

23. Un método de búsqueda de fármacos neuroprotectores que comprende las siguientes etapas:

(a) el cultivo de un modelo in vitro en tres dimensiones de degeneración del sistema nervioso central según 65 cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21;

(b) la adición de un compuesto a ensayar o una mezcla de compuestos activos al modelo de la etapa (a) ; y

(c) el estudio del efecto de la adición del compuesto a ensayar o la mezcla de compuestos de la etapa (b) en el modelo de la etapa (a) .

24. El método según la reivindicación 23, donde en la etapa (c) se estudia al menos uno de los parámetros de la 5 lista que comprende: viabilidad celular, la reactividad glial, la reacción inflamatoria, la morfología celular, la fisiología celular.

FIG.1

FIG.2