Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina.

Un método para producir L-metionina y ácidos orgánicos, que comprende las siguientes etapas:

1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante fermentación de dicha cepa, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se preparar mediante eliminación o debilitamiento de la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa implicadas en la degradación de precursor de L-metionina y potenciando la actividad de homoserina O-succinil transferasa o de homoserina O-acetil transferasa implicada en la síntesis de precursor de L-metionina a partir de homoserina; y

2) producir L-metionina y ácidos orgánicos mediante reacción enzimática usando el precursor de L-metionina y metilmercaptano como sustratos, donde la reacción enzimática es inducida mediante enzimas o cepas microbianas que contienen la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa, donde el precursor de L-metionina es O-acetil homoserina u O-succinil homoserina.

Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina Campo Técnico La presente invención se refiere a un método para producir L-metionina y ácido orgánico. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para producir L-metionina y ácido orgánico con un alto rendimiento mediante reacción de conversión enzimática a partir de precursor de L-metionina producido por fermentación de una cepa productora de precursor de L-metionina preparada según la presente invención. El método de la presente invención para producir L-metionina es más beneficioso medioambientalmente que el método convencional y permite una producción selectiva de L-metionina para usar L-metionina en diversos campos de la industria como aditivo alimentario para piensos y comidas, y como materia prima para suministros médicos y fármacos, etc.

Antecedentes de la Técnica La metionina es uno de los aminoácidos esenciales del cuerpo humano que se ha usado ampliamente como aditivo alimentario para piensos y comidas, y además se ha usado como materia prima sintética para disoluciones médicas y suministros médicos. La metionina actúa como precursor de compuestos tales como la colina (lecitina) y la creatina y al mismo tiempo se usa como materia prima sintética para la cisteína y la taurina. La metionina también puede proporcionar azufre. La S-adenosilmetionina se deriva de la L-metionina y desempeña una función concreta para proporcionar grupos metilo en el organismo humano, y también está implicada en la síntesis de varios neurotransmisores en el cerebro. La metionina y/o la S-adenosil-L-metionina (SAM) inhiben la acumulación de grasa en el hígado y las arterias, y alivian la depresión, la inflamación, la enfermedad hepática y el dolor muscular, etc.

Las funciones in vivo de la metionina y/o la S-adenosil-L-metionina conocidas hasta el momento son las siguientes:

1) Inhibe la acumulación de grasa en el hígado y las arterias promoviendo el metabolismo de lípidos, y mejora la circulación sanguínea en el cerebro, el corazón y el riñón (J. Hepatol. Jeon BR et al., marzo de 2001; 34 (3) : 395401) .

2) Promueve la digestión, la destoxificación y la excreción de sustancias tóxicas, y la excreción de metales pesados tales como el Pb.

3) Puede administrarse como un agente anti-depresivo en una dosis de 800 – 1.600 mg/día (Am. J. Clin. Nutr. Mischoulon D. et al., noviembre de 2002; 76 (5) : 1158S-61S) .

4) Potencia las funciones hepáticas (FASEB J. Mato JM., enero de 2002; 16 (1) : 15-26) y es particularmente efectiva para la enfermedad hepática provocada por el alcohol (Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4) : CD0022359.

5) Tiene un efecto anti-inflamatorio sobre las enfermedades óseas y de las articulaciones, y promueve la recuperación de articulaciones (ACP J Club. Sander O., enero-febrero de 2003; 138 (1) : 21, J. Fam. Pract., Soeken KL et al., mayo de 2002; 51 (5) : 425-30) .

6) Es un nutriente esencial para el cabello. Proporciona nutrición al cabello y con ello previene la pérdida de pelo (Audiol. Neurootol., Lockwood DS et al., septiembre-octubre de 2000; 5 (5) : 263-266) .

La metionina puede sintetizarse química o biológicamente para ser aplicada a piensos, comida y medicinas.

En la síntesis química, la metionina se produce principalmente mediante hidrólisis de 5- (β-metilmercaptoetil) hidantoína. La metionina sintetizada químicamente presenta la desventaja de ser producida únicamente como una mezcla del tipo L y el tipo D.

En la síntesis biológica, la metionina se produce mediante un método que usa proteínas implicadas en la síntesis de metionina. La L-metionina se biosintetiza a partir de homoserina por acción de la enzima expresada por genes tales como metA, metB, metC, metE y metH. Particularmente, el metA es el que codifica homoserina O-succinil transferasa, que es la primera enzima necesaria para la biosíntesis de metionina, y convierte homoserina en Osuccinil-L-homoserina. La O-succinilhomoserina liasa o cistationina gamma sintasa codificada por el gen metB convierte la O-succinil-L-homoserina en cistationina. La cistationina beta liasa codificada por el gen metC convierte la cistationina en L-homocisteína. El metE codifica metionina sintasa independiente de cobalamina y el metH codifica metionina sintasa dependiente de cobalamina, y ambos convierten L-homocisteína en L-metionina. En este punto, la 5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa codificada por metF y la serina hidroximetiltransferasa codificada por glyA trabajan juntas para sintetizar N (5) -metiltetrahidrofolato que proporciona el grupo metilo necesario para la síntesis de L-metionina.

La L-metionina es sintetizada por una serie de reacciones orgánicas catalizadas por las anteriores enzimas. La modificación genética de las proteínas anteriores o de otras proteínas que afecten a las proteínas anteriores podría dar como resultado la regulación de la síntesis de L-metionina. Por ejemplo, la Publicación de Patente Abierta Japonesa Nº 2000/139471 describe un método para la producción de L-metionina con la Escherichia sp. a la que se han eliminado los genes thrBC y metJ, el gen metBL ha sido sobre-expresado y el metK se ha reemplazado por un mutante. Asimismo, la Publicación de Patente de EE.UU. Nº US2003/00920026 A1 describe un método que usa un microorganismo de bloqueo de metD (inhibidor de la síntesis de L-metionina) que pertenece a Cor y nerbacterium sp. La Publicación de Patente de EE.UU. Nº US2002/0049305 describe un método para incrementar la producción de Lmetionina aumentando la expresión de 5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa (metF) .

La Patente de EE.UU. Nº US2005/0054060 A1 describe el método de preparación de microorganismo productor de L-metionina que usa un mutante de cistationina sintasa (O-succinilhomoserina liasa) . Esta cistationina sintasa mutante puede producir homocisteína o metionina directamente a partir de H2S o CH3SH en lugar de cisteína. En este método, el mutante de cistationina sintasa se introduce directamente en una célula y participa en el procedimiento de biosíntesis de metionina intracelular. En este método, la reacción de cistationina sintasa no es muy efectiva debido al uso de la ruta de biosíntesis de metionina intracelular. También, la elevada toxicidad del H2S o el CH3SH para las células reduce la eficacia de este método. En nuestro experimento, también descubrimos que la especificidad de sustrato de la cistationina sintasa para CH3SH es muy lenta comparada con la succinilhomoserina liasa derivada de Pseudomonas o Chromobacterium sp.

Según las publicaciones anteriores, la cistationina sintasa tiende a producir varios productos por reacción con varios sustratos. La cistationina sintasa media en la interacción entre la homocisteína y la O-succinil homoserina para producir homolantionina con una elevada eficacia (J. Bacteriol. (2006) vol. 188: p. 609-618) . La cistationina sintasa de una célula puede interaccionar con varios precursores de metionina y puede producir varios subproductos con una elevada eficiencia. Por tanto, la sobreexpresión de Cistationina sintasa puede reducir la eficacia de la reacción debido a la mayor producción de subproductos.

La metionina producida mediante el método biológico convencional es de tipo L, lo que tiene ventajas, pero la cantidad de producción es demasiado baja. Esto es debido a que la ruta biosintética de metionina tiene sistemas de regulación retroalimentados muy estrictos. Una vez que la metionina se ha sintetizado a un nivel determinado, la metionina del producto final inhibe la transcripción del gen metA que codifica la proteína primaria para el inicio de la biosíntesis de metionina. La sobre-expresión del gen metA por sí misma no puede aumentar la producción de metionina debido a que el gen metA es suprimido por la metionina en la etapa de transcripción y a continuación es degradado por las proteasas intracelulares de la etapa de traducción (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan y Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37 (6) , 1436-1443) . Por lo tanto, muchas de las patentes previas se han centrado en cómo liberar el gen metA de su sistema de regulación de retroalimentación (WO2005/108561, WO1403813) .

Cuando se produce la metionina en un sistema biológico, la metionina producida se convierte en Sadenosilmetionina mediante S-adenosilmetionina sintasa en la ruta de degradación de la metionina. La Sadenosilmetionina sintasa no puede ser eliminada ya que la S-adenosilmetionina es una sustancia esencial en las células. Según las patentes... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir L-metionina y ácidos orgánicos, que comprende las siguientes etapas:

1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante fermentación de dicha cepa, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se preparar mediante eliminación o debilitamiento de la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa implicadas en la degradación de precursor de L-metionina y potenciando la actividad de homoserina O-succinil transferasa o de homoserina O-acetil transferasa implicada en la síntesis de precursor de L-metionina a partir de homoserina; y

2) producir L-metionina y ácidos orgánicos mediante reacción enzimática usando el precursor de L-metionina y metilmercaptano como sustratos, donde la reacción enzimática es inducida mediante enzimas o cepas microbianas que contienen la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa, donde el precursor de L-metionina es O-acetil homoserina u O-succinil homoserina.

2. El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se selecciona del grupo que consiste en Escherichia sp. o Cor y nebacterium sp.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, donde la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se deriva de cepa productora de L-treonina, L-isoleucina o L-lisina seleccionada de Escherichia sp. o Cor y nebacterium sp.

4. El método según la reivindicación 1, donde la cistationina gamma sintasa o la O-succinil homoserina sulfhidrilasa o la O-acetil homoserina sulfhidrilasa de la etapa 1) están codificadas respectivamente por metB o metZ o metY, o sus genes mutantes.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la cepa productora de precursor de Lmetionina de la etapa 1) se caracteriza por usar la cepa cuya ruta de biosíntesis de treonina, isoleucina o lisina es debilitada o eliminada.

6. El método según la reivindicación 5, donde la cepa se caracteriza por la eliminación o el debilitamiento de homoserina quinasa codificada por el gen thrB.

7. El método según la reivindicación 1, donde la síntesis de precursor de L-metionina es potenciada por la sobreexpresión de gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa o gen metX que codifica homoserina O-acetil transferasa.

8. El método según la reivindicación 1, donde el gen auténtico de homoserina O-succinil transferasa de un microorganismos es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen de homoserina O-acetil transferasa con el objetivo de potenciar la síntesis de O-acetil homoserina, o donde el gen auténtico de homoserina acetil transferasa de un microorganismo es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen de homoserina O-succinil transferasa con el objetivo de potenciar la biosíntesis de O-succinil homoserina.

9. El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se prepara mediante el proceso completo, o una parte, del método de la reivindicación 2 a la reivindicación 8.

10. El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se deriva de la cepa productora de treonina MF001 de Escherichia coli libre de dependencia de metionina (Nº de acceso: KCCM-10568) .

11. El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se selecciona del grupo que consiste en CJM-BTJ (pMetA-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10767) que es la cepa productora de O-succinil homoserina, CJM-BTJ (ptJ-MetA-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10872) que es la cepa productora de O-succinil homoserina, y CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10873) que es la cepa productora de O-acetil transferasa.

12. El método según la reivindicación 1, donde la enzima convertidora de la etapa 2) que convierte el precursor de Lmetionina en metionina se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en Escherichia sp., Cor y nebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacterium sp., Hyphomonas sp., Chromobacterium sp. y Norcardia sp. o levaduras.

13. El método según la reivindicación 1, donde la enzima convertidora de la etapa 2) que convierte precursor de Lmetionina en metionina se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en las siguientes cepas:

Escherichia coli, Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida, Cor y nebacteria glutamicum, Leptospira meyeri, Saccharomyces cerevisiae, Chromobacterium violaceum, Nocardia farcinica, Bradyrhizobium japonicum, Hyphomonas neptunium, Methylococcus capsulatus, Methylobacillus flagellatus, Nitrosomas europaea, Klesiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Shigella flexneri, Colwellia psychrer y thraea y Salmonella entérica serovar paratyphi A.

14. Una cepa para la producción de precursor de L-metionina de la etapa 1) de la reivindicación 1, donde dicha cepa es tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ó 10 a 13.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8