Microesferas que contienen oligonucleótidos, su utilización para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes tipo 1.

Microesferas que comprenden oligonucleótidos dirigidas a unir transcriptosprimarios seleccionados del grupo consistente en transcriptos primariosCD40,

CD80 y CD86 y combinaciones de los mismos, donde losoligonucleótidos sub-regulan o suprimen la expresión in vivo de CD40,CD80 y/o CD86 y donde los oligonucleótidos constituyen más del 30 porciento en peso de las microesferas, con respecto al peso total de lasmicroesferas, teniendo dichas microesferas un tamaño medio de partículano mayor a 50 micras.

Microesferas que contienen oligonucleótidos, su utilización para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes tipo 1

Campo de la invención En general, la presente invención se refiere a la administración de microesferas de oligonucleótidos AS de acuerdo con la reivindicación 1 para inducir tolerancia de células dendríticas, en particular en un modelo de ratón diabético no obeso (NOD) . En particular, la invención se refiere a la tecnología de administración de medicamentos a través de microesferas fabricadas bajo condiciones completamente acuosas, incorporando las microesferas oligonucleótidos antisentido. Estas microesferas se utilizan por un enfoque antisentido para prevenir una condición de diabetes autoinmune en ratones NOD in vivo e in situ.

Antecedentes de la invención Las micropartículas, microesferas y microcápsulas son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro inferior a un milímetro, preferentemente inferior a 100 micras, que se pueden obtener a partir múltiples materiales, incluyendo polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las microesferas se han utilizado para diversos tipos de administración diferentes, en particular separaciones,

diagnósticos y para la administración de medicamentos.

Para la elaboración de estas microesferas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas y polisacáridos se pueden utilizar diferentes técnicas, incluyendo separación de fases, evaporación de disolventes, emulsificación y secado por pulverización. Generalmente los polímeros forman la 25 estructura que soporta estas microesferas y el medicamento en cuestión se incorpora a la estructura polimérica. Ejemplos de polímeros que se utilizan para la formación de microesferas incluyen homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico (PLGA) tal como los descritos en la patente US No. 5.213.812 de Ruiz, US No. 5.417.986 de Reid y col., patente US No. 4.530.840 de Tice y col., 30 patente US No. 4.897.268 de Tice y col., patente US No. 5.075.109 de Tice y col., patente US No. 5.102.872 de Singh y col., patente US No. 5.384.133 de Boyes y col., patente US No. 5.360.610 de Tice y col. y en la Solicitud de Patente Europea número de publicación 248.531 del Southern Research Institute; copolímeros en bloque como Tetronic 908 y Poloxamer 407 como los descritos en la patente US

No. 4.904.479 de Illum ; y polifosfacenos como los descritos en la patente US No.

5.149.543 de Cohen y col. Las microesferas producidas utilizando polímeros, como tales tienen una escasa capacidad de carga y, con frecuencia, sólo pueden incorporar un porcentaje pequeño del medicamento de interés en la estructura polimérica. Por ello, es necesario administrar una cantidad sustancial de microesferas para alcanzar un efecto terapéutico.

Durante muchos años los bioquímicos han tenido a su disposición comercialmente herramientas como perlas o partículas esféricas. Los anticuerpos conjugados en perlas por ejemplo, producen partículas relativamente grandes específicas para ligandos particulares.

Las partículas grandes recubiertas de anticuerpos se utilizan habitualmente para reticular receptores sobre la superficie de una célula con el fin de su activación, se enlazan a una fase sólida para una purificación de inmunoafinidad y pueden utilizarse para suministrar un agente terapéutico que se libera lentamente con el

tiempo, utilizando anticuerpos tisulares o específicos tumorales conjugados en las partículas para dirigir el agente al punto deseado.

Una desventaja de las micropartículas o perlas disponibles actualmente consiste en que son difíciles y caras de producir. Las micropartículas producidas por estos métodos conocidos tienen una distribución de tamaño de partícula amplia, con 20 frecuencia carecen de uniformidad y no demuestran tener características cinéticas de liberación a largo plazo cuando la concentración de ingredientes activos es alta. Además, los polímeros utilizados con estos métodos conocidos se disuelven en disolventes orgánicos para formar las micropartículas. Éstas, por tanto, deben producirse en equipos especiales diseñados para manipular disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos podrían desnaturalizar las proteínas o péptidos contenidos en las micropartículas. Los disolventes orgánicos residuales pueden ser tóxicos cuando se administran al ser humano o a animales.

Además, las micropartículas disponibles raramente tienen un tamaño lo suficientemente pequeño como para atravesar la abertura de las agujas 30 normalmente utilizadas en la administración terapéutica o para ser útiles en la administración por inhalación. Por ejemplo, las micropartículas preparadas con ácido glicólico-poliláctico (PLGA) son grandes y tienden a agregarse. Es necesario un paso de selección de tamaño, lo que conlleva pérdida de producción, con el fin de retirar las partículas demasiado grandes para ser 35 inyectadas. Las partículas de PLGA con un tamaño adecuado para la inyección deben administrarse a través de una aguja de gran calibre para poder alojar estas partículas de gran tamaño, lo que con frecuencia resulta incómodo para el paciente.

Generalmente muchas micropartículas actualmente disponibles están activadas para liberar su contenido en un medio acuoso y, por tanto, deben liofilizarse para 5 impedir una liberación prematura. Además, partículas tales como aquellas preparadas utilizando el sistema PLGA, muestran características de cinéticas de liberación basadas tanto en la erosión como en la difusión. En este tipo de sistema, se observa un estallido inicial o liberación rápida del medicamento. Este efecto estallido puede resultar en efectos secundarios no deseados para el

paciente al que se ha administrado las partículas.

Son conocidas las micropartículas preparadas con lípidos para encapsular los medicamentos de interés. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos dispuestos en membranas bicapa que rodean múltiples compartimentos acuosos para formar partículas con el fin de encapsular medicamentos solubles en agua para su 15 administración subsiguiente según se describe en la patente US No.5.422.120, de Simil Kim. Normalmente, estas partículas tienen un tamaño superior a 10 micras y se diseñan para la administración intraarticular, intratecal, subcuntánea y epidural. Alternativamente se han utilizado liposomas para la administración intravenosa de pequeñas moléculas. Los liposomas son partículas esféricas compuestas por una 20 bicapa o múltiples bicapas de fosfolípido y colesterol. Los liposomas tienen un tamaño de 30 micras o superior y pueden portar diversos medicamentos solubles en agua o en lípidos. La tecnología de liposomas se ha visto obstaculizada por problemas, incluyendo la pureza de los componentes lipídicos, posible toxicidad, heterogeneidad vesicular, absorción excesiva y dificultades de elaboración o de vida en almacenaje.

Un objetivo para la comunidad médica es la administración de ácidos nucleicos a las células de un animal para el tratamiento de la diabetes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden administrarse a las células en cultivos (in vitro) de forma relativamente eficaz, pero las nucleasas provocan una alta proporción de degradación del ácido nucleico cuando éste se suministra a animales (in vivo) .

Además de proteger el ácido nucleico de la digestión por nucleasas, el vehículo de suministro del ácido nucleico debe tener baja toxicidad, debe ser absorbido de modo eficaz por las células y tiene que tener una formulación bien definida, de fácil elaboración. Según demuestran las pruebas clínicas, los vectores virales 35 para el suministro pueden resultar en una respuesta inmune adversa grave, incluso fatal, in vivo. Además, este método tiene el potencial de poseer efectos mutágenos in vivo. El suministro del ácido nucleico envuelto en complejos lípidos de diferentes formulaciones (como complejos lípidos catiónicos o liposomas) en general es ineficaz in vivo y puede tener efectos tóxicos. Los complejos de ácidos nucleicos con diferentes polímeros o con péptidos han dado resultados contradictorios y la toxicidad de estas formulaciones no se ha resuelto hasta la fecha. También se han encapsulado ácidos nucleicos en matrices poliméricas para su administración, pero en estos casos las partículas tienen un amplio rango de tamaño y la eficacia en fines terapéuticos no ha sido todavía demostrada.

Existe, por tanto, la necesidad de investigar el suministro de ácidos nucleicos y

existe una necesidad constante de desarrollar microesferas y nuevos métodos para su elaboración. En las patentes US No. 6.458.387 de Scott y col., No.... [Seguir leyendo]

1. Microesferas que comprenden oligonucleótidos dirigidas a unir transcriptos primarios seleccionados del grupo consistente en transcriptos primarios CD40, CD80 y CD86 y combinaciones de los mismos, donde los oligonucleótidos sub-regulan o suprimen la expresión in vivo de CD40, CD80 y/o CD86 y donde los oligonucleótidos constituyen más del 30 por ciento en peso de las microesferas, con respecto al peso total de las microesferas, teniendo dichas microesferas un tamaño medio de partícula no mayor a 50 micras.

2. Microesferas según la reivindicación 1, caracterizadas porque comprenden un primer oligonucleótido antisentido dirigido al transcripto primario CD40, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido al transcripto primario CD80 y un tercer oligonucleótido antisentido dirigido al transcripto primario CD86, donde cada uno de dichos primeros, segundos y terceros oligonucleótidos sub-regula o suprime la expresión in vivo de CD40, CD80 y CD86 respectivamente.

3. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizadas porque comprenden además un policatión.

4. Microesferas según la reivindicación 3, caracterizadas porque consisten esencialmente en oligonucleótidos antisentido y el policatión.

5. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque son capaces de ser recogidas por las células dendríticas.

6. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizadas porque están en una composición inyectable adecuada para la administración in vivo.

7. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizadas porque son adecuadas para la administración subcutánea.

8. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque tienen un tamaño medio de partícula inferior a 50 micras.

9. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque tienen un tamaño de partícula de 0, 2 micras a 8 micras.

10. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque tienen un tamaño de partícula de 0, 5 micras a 4 micras.

11. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 2 micras.

12. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 2, 5 micras.

13. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su utilización en medicina.

14. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento de la diabetes tipo 1.

15. Microesferas inyectables según la reivindicación 14.

16. Utilización de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 114 en la fabricación de un medicamento para el suministro de ácidos

nucleicos en forma de una composición de microesferas a una persona con diabetes tipo 1 por una vía de administración seleccionada del grupo consistente en la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, intradermal, intraperitoneal, oral, pulmonar, ocular, nasal y rectal.

17. Utilización de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1

15 en la fabricación de un medicamento para proteger las células beta del páncreas de ratones diabéticos no obesos de la destrucción autoinmune, incluyendo la inyección subcutánea de las microesferas.

18. Utilización de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 115 para la fabricación de un medicamento para proteger las células beta del páncreas de individuos de la destrucción autoinmune mediante inyección subcutánea de la composición, opcionalmente siendo el individuo un humano.

19. Utilización de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 115 en la fabricación de un medicamento para proteger las células beta del

páncreas de individuos de la destrucción autoinmune y de la aparición de diabetes tipo 1 mediante inyección subcutánea de las microesferas.