Métodos para restaurar el repertorio inmune en pacientes con defectos inmunológicos relacionados con la autoinmunidad y trasplante de órganos o de células madre hematopoyéticas.

Un método ex vivo para eliminar al menos una porción sustancial de una subpoblación de células T clonales de unapoblación mixta de células T de un individuo,

que comprende exponer una población de células, en donde al menosuna porción de estas comprende células T, a una o más composiciones pro-apoptóticas o inhibidoras delcrecimiento en donde dicha exposición induce apoptosis o la inhibición del crecimiento en al menos una porciónsustancial de al menos una población de células T clonales presente en la población mixta de células T; eliminandoasí al menos una porción sustancial de dicha población de células T clonales de la población mixta de células T;caracterizado porque la composición pro-apoptótica o inhibidora del crecimiento comprende un autoantígeno.

Métodos para restaurar el repertorio inmune en pacientes con defectos inmunológicos relacionados con la autoinmunidad y trasplante de órganos o de células madre hematopoyéticas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a métodos para eliminar las subpoblaciones indeseadas de células T (por ejemplo, autorreactivas, alorreactivas, patógenas) de una población mixta de células T.

Descripción de la técnica relacionada La capacidad de las células T para reconocer el universo de antígenos asociados con diversos tipos de cáncer u organismos infecciosos se confiere por su receptor de antígenos de células T (TCR) , que se compone tanto de una cadena a (alfa) y una º (beta) o una cadena V (gamma) y una 0 (delta) . Las proteínas que componen estas cadenas están codificadas por el ADN, que emplea un mecanismo único para la generación de la enorme diversidad de TCR. Este receptor multisubunitario de reconocimiento inmune se asocia con el complejo CD3 y se une a péptidos presentados por las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y II en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) . La unión del TCR al péptido antigénico en la APC es el evento central en la activación de células T, que se produce en una sinapsis inmunológica en el punto de contacto entre la célula T y la APC.

Para mantener la activación de las células T, los linfocitos T típicamente requieren una segunda señal co-estimuladora. La coestimulación es típicamente necesaria para que una célula T auxiliadora produzca suficientes niveles de citocinas que induzcan la expansión clonal. Bretscher, Immunol. Today 13: 74, 1992; June y otros, Immunol. Today 15:321, 1994. La principal señal co-estimuladora se produce cuando un miembro de los ligandos de la familia B7 (CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) ) en una célula presentadora de antígeno activada (APC) se une a CD28 en una célula T.

Los métodos de estimulación de la expansión de ciertos subconjuntos de células T tienen el potencial de generar una variedad de composiciones de células T útiles en la inmunoterapia. La inmunoterapia exitosa puede ayudarse aumentando la reactividad y la cantidad de las células T por estimulación eficiente. Además, en el contexto de la autoinmunidad o el trasplante, la inmunoterapia exitosa puede ayudarse por la eliminación de las células autorreactivas o alorreactiva indeseadas.

Las diversas técnicas disponibles para la expansión de las células T humanas se han basado principalmente en el uso de células accesorias y/o factores de crecimiento exógenos, tales como la interleucina- 2 (IL-2) . La IL-2 se ha usado junto con un anticuerpo anti-CD3 para estimular la proliferación de células T, expandiendo predominantemente la subpoblación de células T CD8+. Se cree que se requieren ambas señales de APC dirigidas hacia el complejo TCR/CD3 y CD28 en la superficie de las células T para la activación óptima de células T, y la expansión y la supervivencia a largo plazo de las células T tras la re-infusión. El requisito de las APC pareadas a MHC como células accesorias presenta un problema importante para los sistemas de cultivo a largo plazo debido a que las APC son relativamente de corta duración. Por lo tanto, en un sistema de cultivo a largo plazo, las APC deben obtenerse continuamente a partir de una fuente y reponerse. La necesidad de un suministro renovable de células accesorias es problemático para el tratamiento de inmunodeficiencias en las que están afectadas las células accesorias. Adicionalmente, cuando se trata una infección viral, si las células accesorias llevan el virus, las células pueden contaminar la población entera de células T durante el cultivo a largo plazo.

En ausencia de factores de crecimiento exógenos o de células accesorias, puede enviarse una señal co-estimuladora a una población de células T, por ejemplo, exponiendo las células a un ligando CD3 y a un ligando CD28 unido a una superficie de fase sólida, tal como una perla. Ver C. June, y otros (patente de los Estados Unidos núm. 5, 858, 358) ; C. June y otros WO 99/953823. Si bien estos métodos son capaces de alcanzar poblaciones terapéuticamente útiles de células T, el aumento de robustez y la facilidad de preparación de células T continúan siendo menos que ideales.

Los métodos disponibles anteriormente en la técnica han hecho uso de anti-CD3 y anti CD28 para la expansión de células T. Shibuya y otros (Archives of Otolar y ngology head and neck surger y , American Medical Association, Estados Unidos, Vol. 126, núm. 4, 2000) revelan un método de simulación de células T ex-vivo para superar la inmunosupresión relacionada con el tumor. Lum y otros (Journal of Immunotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Hagerstown, MD, Estados Unidos, Vol 24, núm. 5, 2001, P408-419) describe un proceso similar al de Shibuya y otros, donde el objetivo es activar las células T anti

tumorales mediante su exposición a anticuerpos inmovilizados anti-CD3 y anti-CD28. Adicionalmente, los métodos actualmente disponibles en la materia no se han centrado en la expansión a corto plazo de las células T o la obtención de una población más robusta de células T y los resultados beneficiosos de estas. Ninguno de estos métodos ha descrito el uso de tales métodos o similares para eliminar una población clonal u oligoclonal de células T indeseada a partir de una población de células T ni los resultados beneficiosos de estas. Por otra parte, los métodos previamente disponibles tienden a sesgar más aún la clonalidad de la población de células T en lugar de eliminar los clones reactivos indeseados de una población de células T, y restaurar un repertorio inmune normal. Para una máxima efectividad in vivo, teóricamente, una población de células T activadas, generadasex vivo o in vivo debe estar en un estado que pueda orquestar al máximo una respuesta inmune al cáncer, enfermedad infecciosa, u otros estados de enfermedad. En el contexto de la autoinmunidad o el trasplante, las poblaciones de células T activadas deben estar en estado de reconstituir un repertorio de células T normales con una presencia reducida o completamente sin la presencia de células T autorreactivas o células T alorreactivas potencialmente patogénicas. Actualmente, los pacientes con enfermedades autoinmunes se tratan con inmunosupresión a largo plazo para inhibir las células T autorreactivas que causan la enfermedad. Cuando se detienen los agentes inmunosupresores, frecuentemente la enfermedad se repite concomitante con la reaparición las células T causantes de la enfermedad que resurgen en estos pacientes. El principal problema en el trasplante de células madre hematopoyéticas es la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , que es causada por las células T alorreactivas presentes en la preparación de células madre hematopoyéticas infundidas. En el trasplante de órganos, el rechazo del injerto mediado por células T alorreactivas del huésped es el principal problema, que por lo general se supera por la inmunosupresión a largo plazo del receptor del trasplante.

La presente invención proporciona métodos para generar un mayor número de células T más puras y altamente activadas que tienen receptor de superficie y características de producción de citocinas que parecen más sanos y naturales que otros métodos de expansión y además proporciona la disminución o eliminación de las poblaciones indeseadas de células T autorreactivas o alorreactivas. La presente invención es útil para proporcionar poblaciones de células T para su uso en el ajuste de las enfermedades autoinmunes, las células madre hematopoyéticas, y el trasplante de órganos, así como otros contextos en donde se desea la reconstitución de un sistema inmune de células T separadas por ablación, abrogado, o de otra manera disfuncional.

Además, cada vez es más reconocido que el envejecimiento del sistema inmunológico se caracteriza por una disminución progresiva de la capacidad de respuesta a los antígenos exógenos y tumores en combinación con un aumento paradójico de la autoinmunidad (C. Weyand y otros Mechanisms of Ageing and Development 102;131-147, 1998; D. Schmidt y otros Molecular Medicine 2:608-618, 1996; G. Liuzzo y otros Circulation 100:2135-2139, 1999) . Estos estudios han descrito que el envejecimiento se asocia con la aparición de un subconjunto de células T cooperadoras que se caracterizan por la pérdida de la expresión de CD28. Las células T CD4+ CD28-son de larga vida, típicamente experimentan expansión clonal in vivo, y reaccionan a los autoantígenos in vitro. La pérdida de la expresión de CD28 se correlaciona con la falta de expresión del ligando CD40 haciendo... [Seguir leyendo]

1. Un método ex vivo para eliminar al menos una porción sustancial de una subpoblación de células T clonales de una población mixta de células T de un individuo, que comprende exponer una población de células, en donde al menos una porción de estas comprende células T, a una o más composiciones pro-apoptóticas o inhibidoras del

crecimiento en donde dicha exposición induce apoptosis o la inhibición del crecimiento en al menos una porción sustancial de al menos una población de células T clonales presente en la población mixta de células T; eliminando así al menos una porción sustancial de dicha población de células T clonales de la población mixta de células T; caracterizado porque la composición pro-apoptótica o inhibidora del crecimiento comprende un autoantígeno.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende expandir la población mixta de células T restante.

3. Un método ex vivo para eliminar al menos una porción sustancial de una subpoblación de células T clonales de una población mixta de células T, que comprende:

a. exponer una población de células en donde al menos una porción de estas comprende células T a una o más composiciones que sensibilizan al menos una porción de las células T a una activación o estimulación posterior,

b. exponer la población de células a una superficie en donde la superficie tiene unido a ella uno o más agentes que ligan una porción de la superficie celular de al menos una porción de las células T sensibilizadas y estimulan dichas células T sensibilizadas, en donde la exposición de dichas células T 20 sensibilizadas a dicha superficie es por un tiempo suficiente para inducir la apoptosis de dichas células T

sensibilizadas; eliminando así dichas células T sensibilizadas de la población; caracterizado porque la composición que sensibiliza comprende un autoantígeno.

4. El método de la reivindicación 3 en donde la etapa (b) comprende además exponer a dicha población de células a dicha superficie por un tiempo suficiente para estimular al menos una porción de las células restantes y en donde al menos dicha porción de las células restantes prolifera.

5. El método de la reivindicación 2 o la reivindicación 4 en donde la población mixta de células restante se expande al

exponer dicha población a una superficie, en donde la superficie tiene unido a ella uno o más agentes que ligan una porción de la superficie celular de al menos una porción de las células T restantes y estimula dichas células T restantes.

6. El método de la reivindicación 5 en donde dicha superficie tiene unido a ella un primer agente que liga una primera porción de la superficie celular de una célula T, y la misma o una segunda superficie tiene unido a ella un segundo agente que liga una segunda porción de dicha célula T, en donde dicha ligación por el primer y el segundo agente induce la proliferación de dichas células T.

7. El método de cualquier reivindicación precedente en donde el autoantígeno se selecciona del grupo que consiste de proteína básica de la mielina (MBP) , MB.

8. 102, MB.

14. 168, antígenos de las células de los islotes pancreáticos, colágeno, antígenos de tiroides, Scl-70, ácido nucleico, receptor de acetilcolina, antígeno S, y colágeno tipo II.

8. El método de cualquier reivindicación precedente en el que la composición pro-apoptótica comprende células 45 alogénicas o xenogénicas.

9. El método de cualquier reivindicación precedente en donde el autoantígeno comprende una o más composiciones seleccionadas del grupo que consiste de: antígenos diana, moléculas de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos, y compuestos no proteicos o no polinucleotídicos.

10. El método de la reivindicación 2 o la reivindicación 4 en donde la exposición de dichas células a dicha superficie es durante un tiempo suficiente para aumentar la policlonalidad.

11. El método de la reivindicación 10 en donde el aumento en la policlonalidad comprende un cambio de la

monoclonalidad a la oligoclonalidad o a la policlonalidad de la población de células T medido por un perfil espectral de V , Va, VV o V0 de al menos un gen de la familia V , Va, VV o V0.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a la 11 en donde al menos un agente es un anticuerpo o un fragmento de este de unión al antígeno.

13. El método de la reivindicación 6 en donde el primer agente es un anticuerpo o un fragmento de este de unión al 5 antígeno, y el segundo agente es un anticuerpo o un fragmento de este de unión al antígeno.

14. El método de la reivindicación 13, en donde los agentes primeros y segundos son anticuerpos diferentes.

15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14 en donde el primer agente es un anticuerpo anti-CD3, un 10 anticuerpo anti-CD2, o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD2.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a la 15, en donde el segundo agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de este de unión al antígeno.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a la 16, en donde el primer agente es un anticuerpo anti-CD3 y el segundo agente es un anticuerpo anti-CD28.

18. El método de cualquier reivindicación precedente, que además comprende la formulación de la población de células T así generada para su uso terapéutico.

19. El método de la reivindicación 3 en donde la composición que sensibiliza comprende los PBMC del receptor que se trataron de manera que no sean capaces de continuar dividiéndose y la población de células T comprende células T del donante.

20. El método de la reivindicación 3 en donde la composición que sensibiliza comprende células del donante que se trataron de manera que no sean capaces de dividirse y la población de células comprende células T del receptor.

FIG. 1

FIG. 2

AB

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7