Métodos para predecir y superar la resistencia a quimioterapia en cáncer de ovario.

Al menos un inhibidor ARNip o ARNhc del gen celular S100A10 para su uso en la disminución de laresistencia a un fármaco quimioterapéutico de una célula tumoral de cáncer de ovario que se trata con elfármaco quimioterapéutico,

en donde la célula es menos resistente al fármaco quimioterapéutico en presenciadel inhibidor que en ausencia del inhibidor.

Métodos para predecir y superar la resistencia a quimioterapia en cáncer de ovario

Campo de la invención La invención se refiere a métodos para predecir si un tumor de una paciente de cáncer de ovario será resistente a quimioterapia.

La invención también se refiere a métodos para seguir la eficacia de la terapia en una paciente tratada para el cáncer de ovario.

La invención también se refiere a compuestos para reducir la resistencia al tratamiento o terapia con fármacos quimioterapéuticos en células de cáncer de ovario que son resistentes a pautas de tratamiento quimioterapéutico convencionales.

Antecedentes de la invención El cáncer de ovario es el más letal de los tumores malignos ginecológicos con un índice de mortalidad del 60%. Los índices de supervivencia de cinco años para los diferentes estadios clínicos de la enfermedad son como sigue: estadio I > 90%, estadio II = 80%, estadio III = 20% y estadio IV = 10%; hay una caída significativa en los índices de supervivencia en los estadios tardíos de la enfermedad. El tratamiento de referencia para estadios avanzados de la enfermedad incluye cirugía citorreductora seguida por quimioterapia.

Para la mayoría de las pacientes hay una baja probabilidad de supervivencia, ya que aproximadamente el 75% de todas las pacientes son diagnosticadas en los estadios III y IV de la enfermedad y el mal pronóstico se asocia con el diagnostico tardío de la enfermedad en sus estadios avanzados. Otro problema principal es la resistencia a los agentes quimioterapéuticos actualmente disponibles. Aunque la respuesta clínica completa se alcanza en el 75% de las pacientes después del tratamiento inicial, la mayoría desarrollarán enfermedad recurrente y requerirán volver a tratarse. Desgraciadamente, la inmensa mayoría finalmente desarrollará quimiorresistencia y sucumbirá a la enfermedad.

La quimiorresistencia es un fenómeno complejo que implica un cambio en la expresión y actividad biológica de varios genes y productos génicos. Se pueden usar genes o familias de genes que se expresan diferentemente en individuos sensibles y no sensibles como marcadores moleculares para predecir qué pacientes podrían ser resistentes a un agente quimioterapéutico particular o una combinación de los mismos, como típicamente se usa clínicamente. Además, los genes que se sobreexpresan en individuos quimiorresistentes pueden ser dianas para su inhibición, que puede disminuir la resistencia de una célula cancerosa a un agente o agentes quimioterapéutico (s) .

Como con el cáncer de ovario, la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal es mejor cuando la enfermedad se diagnostica pronto. Si el cáncer se detecta pronto, el índice de supervivencia de cinco años para los pacientes de cáncer de colon es aproximadamente el 90%; desgraciadamente, a pesar de la vigilancia aumentada y las medidas preventivas, solo el 37% de los cánceres se encuentran en este estadio temprano. Cuando el cáncer se ha extendido regionalmente para afectar a otros órganos el índice de supervivencia cae a aproximadamente al 64% y disminuye drásticamente (8%) después de que el cáncer haya metastatizado (Cancer Facts and Figures 2002; publicación de la American Cancer Society) .

Por tanto, hay una necesidad para identificar cánceres de colon y ovario pronto en el curso del proceso de la enfermedad, y una necesidad particular para identificar cánceres que son quimiorresistentes. Más específicamente, puesto que en la técnica se entiende que el comportamiento de las células cancerosas, tanto respecto a su tumorigenicidad como a su resistencia a fármacos quimioterapéuticos, está mediado por la expresión de un conjunto de genes particulares no completamente definidos, hay una necesidad en la técnica para identificar genes y colecciones o conjuntos de genes que sirvan como marcadores moleculares eficaces para la quimiorresistencia en cáncer de ovario, así como tales genes o conjuntos de genes que proporcionen dianas terapéuticas clínicamente eficaces para el cáncer de ovario y el cáncer de colon.

La presente solicitud se refiere a métodos y reactivos para identificar genes implicados en, o cuya expresión está modulada por, o en donde dicha expresión modulada se asocia con o es responsable de resistencia a un tratamiento con fármacos quimioterapéuticos. En particular, la divulgación proporciona genes implicados en, o cuya expresión está modulada por, o en donde dicha expresión modulada se asocia con o es responsable de resistencia a un tratamiento con fármacos quimioterapéuticos, así como patrones de expresión génica modulada de una pluralidad de genes en donde dichos patrones son característicos de células resistentes a fármacos quimioterapéuticos, particularmente de células de cáncer de ovario resistentes a fármacos. Además se proporcionan métodos para identificar compuestos que interaccionan con o afectan la expresión o la actividad de uno o una pluralidad de dichos genes. También se proporcionan dichos compuestos que son útiles como alternativas a o junto a agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer de ovario, particularmente tales cánceres que son o se han vuelto resistentes al tratamiento quimioterapéutico convencional. También se proporcionan métodos y reactivos para seguir el tratamiento quimioterapéutico para identificar pacientes cuyos tumores son o se han vuelto resistentes a agentes quimioterapéuticos.

Además se divulgan métodos para identificar compuestos que disminuyen la resistencia a fármacos quimioterapéuticos e inhiben, retrasan o previenen el crecimiento de células tumorales, lo más preferiblemente células de cáncer de ovario, que son resistentes a un agente quimioterapéutico, el método comprende los pasos de:

(a) poner en contacto con un compuesto de prueba una célula resistente a fármacos quimioterapéuticos que crece en presencia de un agente quimioterapéutico durante un tiempo o a una concentración en donde la célula es resistente al fármaco y en donde la célula expresa al menos un gen que se sobreexpresa en células de cáncer de ovario quimiorresistentes, en donde el gen sobreexpresado es S100A10, S100A11, calpaína 2, SPARC, MetAP2, KLK6, ARA9, calponina 2, RNPS1, eIF5, eIF2B£, HSF2, WDR1, dedos fusionados, NM23D, ADAR1, grancalcina, NBR1, SAPK/Erk1, proteína con dedo de zinc-262 MYM, HYA22, MRPL4, vinexina º, G-CSFR, IGFBP-7, quinasa FAST, TESK2, SRB1 o KIAA0082 (identificados por los números de acceso de GenBank mostrados en la tabla 1) ;

(b) ensayar la expresión o actividad de uno o una pluralidad de dichos genes o productos génicos en dichas células en presencia y ausencia del compuesto de prueba; y/o (c) comparar el crecimiento celular y/o la expresión o actividad de al menos uno de los genes o productos génicos en presencia y ausencia del compuesto de prueba, en donde un compuesto se identifica como un compuesto que inhibe el crecimiento de células tumorales quimiorresistentes si la expresión o actividad del gen o producto génico en presencia del compuesto de prueba se reduce relativa a la expresión del gen en ausencia del compuesto de prueba, o si el crecimiento celular se inhibe en presencia del compuesto, o ambos. En ciertas formas de realización, la expresión génica se detecta ensayando una muestra biológica usando una matriz de, entre otros, sondas de ácidos nucleicos (genes) o anticuerpos específicos para una pluralidad de productos génicos identificados en el presente documento.

También se divulgan métodos para disminuir la resistencia a fármacos, o inhibir, retrasar o prevenir el crecimiento de una célula tumoral, o ambos, que comprende el paso de poner en contacto la célula tumoral con al menos un inhibidor de un gen celular, en donde el gen celular es S100A10, S100A11, calpaína 2, SPARC, MetAP2, KLK6, ARA9, calponina 2, RNPS1, eIF5, eIF2B£, HSF2, WDR1, dedos fusionados, NM23D, ADAR1, grancalcina, NBR1, SAPK/Erk1, proteína con dedo de zinc-262 MYM, HYA22, MRPL4, vinexina º, G-CSFR, IGFBP-7, quinasa FAST, TESK2, SRB1 o KIAA0082 en presencia de un fármaco quimioterapéutico durante un tiempo o a una concentración en donde la célula es resistente al fármaco en ausencia del inhibidor del gen celular. En formas de realización preferidas, la célula tumoral es una célula tumoral humana, y más preferiblemente una célula de cáncer de ovario. En aspectos particulares, uno o una pluralidad de los genes identificados según la invención se inhiben con ARN antisentido o moléculas de ARNip específicamente diseñadas para dirigirse a uno o una pluralidad de dichos genes. En aspectos alternativos, los productos génicos de dichos genes se inhiben usando inhibidores de estas proteínas.

También se divulgan... [Seguir leyendo]

1. Al menos un inhibidor ARNip o ARNhc del gen celular S100A10 para su uso en la disminución de la resistencia a un fármaco quimioterapéutico de una célula tumoral de cáncer de ovario que se trata con el fármaco quimioterapéutico, en donde la célula es menos resistente al fármaco quimioterapéutico en presencia del inhibidor que en ausencia del inhibidor.

2. El inhibidor de la reivindicación 1, en donde el inhibidor es un ARNip que tiene 19, 20 o 21 nucleótidos de longitud.

3. El inhibidor de la reivindicación 1, en donde el inhibidor es un ARNhc que forma un bucle en horquilla con brazos que tienen 19, 20 o 21 nucleótidos de longitud.

4. El inhibidor de la reivindicación 1, en donde el agente quimioterapéutico es cisplatino.

5. El inhibidor de la reivindicación 1, en donde el ARNip es SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61.

6. Uso de al menos un inhibidor ARNip o ARNhc del gen celular S100A10 en la fabricación de un medicamento para disminuir la resistencia a un fármaco quimioterapéutico de una célula tumoral de cáncer de ovario que se trata con el fármaco quimioterapéutico, en donde la célula es menos resistente al fármaco quimioterapéutico en presencia del inhibidor que en ausencia del inhibidor.

7. Una combinación de un agente o agentes quimioterapéutico (s) y al menos un inhibidor ARNip o ARNhc del gen celular S100A10 para su uso en la inhibición del crecimiento de una célula tumoral de cáncer de ovario.

8. La combinación de la reivindicación 7, en donde el agente quimioterapéutico se basa en platino.

9. La combinación de la reivindicación 7, en donde el inhibidor es un ARNip identificado como SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61.

10. Uso de una combinación de un agente o agentes quimioterapéutico (s) y al menos un inhibidor ARNip o ARNhc del gen celular S100A10 en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula tumoral de cáncer de ovario.

11. Un método in vitro de predecir si el tumor de una paciente de cáncer de ovario es resistente a un fármaco quimioterapéutico que comprende los pasos de:

a. detectar una cantidad de un gen expresado o producto génico codificado por dicho gen expresado en una muestra biológica tomada de la paciente, en donde el gen expresado es S100A10;

b. detectar una cantidad de un gen expresado o producto génico codificado por el mismo en una muestra control, en donde el gen expresado es S100A10;

c. comparar la cantidad del gen expresado o producto génico detectado en el paso (a) con la cantidad

del gen expresado o producto génico detectado en el paso (b) , en donde se predice que la paciente es resistente al fármaco quimioterapéutico cuando la cantidad detectada en el paso (a) es mayor que la cantidad detectada en el paso (b) en un factor de al menos el 20%.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la quimioterapia es quimioterapia basada en cisplatino.

13. Un método in vitro para seguir la evolución de la enfermedad del cáncer de ovario en una paciente, que comprende los pasos de:

a. detectar una cantidad de un gen expresado o producto génico codificado por el gen expresado en una muestra biológica tomada de la paciente, en donde el gen expresado es S100A10;

b. repetir el paso (a) usando una muestra biológica recogida posteriormente obtenida de la paciente; y

c. comparar la cantidad del gen expresado o producto génico detectado en el paso (a) con la cantidad del gen expresado o producto génico detectado en el paso (b) , en donde el cáncer ha progresado cuando la cantidad detectada en el paso (b) no es menor que la cantidad detectada en el paso (a) para S100A10.

14. Un método in vitro para identificar un compuesto que disminuye la resistencia a fármacos de una célula tumoral de cáncer de ovario quimiorresistente que comprende los pasos de:

a. poner en contacto con un compuesto de prueba junto con un fármaco quimioterapéutico a una concentración a la que es resistente una célula que expresa un gen que se sobreexpresa en células de cáncer de ovario quimiorresistentes, en donde el gen es S100A10;

b. detectar la expresión del gen en presencia y ausencia del compuesto de prueba; y

c. comparar la expresión del gen en presencia y ausencia del compuesto de prueba, en donde un

compuesto se identifica como un compuesto que inhibe el crecimiento de una célula tumoral de cáncer

de ovario quimiorresistente si la expresión del gen en presencia del compuesto de prueba se reduce

5 relativa a la expresión del gen en ausencia del compuesto de prueba, y donde el crecimiento de la

célula tumoral de cáncer de ovario disminuye en presencia del compuesto.

15. Un método in vitro para seguir la eficacia de una composición farmacéutica como un agente para tratar cáncer

de ovario en una paciente que comprende los pasos de:

10

a. detectar una cantidad de un gen expresado o producto génico codificado por el mismo en una muestra

biológica tomada de una paciente, en donde el gen expresado es S100A10;

b. repetir el paso (a) usando una muestra biológica recogida posteriormente obtenida de la paciente

después de la administración de una cantidad de una composición farmacéutica a la paciente; y

15 c. comparar la cantidad del gen expresado o producto génico detectado en el paso (a) con la cantidad

del gen expresado o producto génico detectado en el paso (b) , en donde la eficacia de la composición

farmacéutica se sigue detectando cambios en la cantidad de gen expresado o producto génico en la

muestra biológica recogida posteriormente comparada con la muestra biológica tomada en el paso (a) ,

y donde el crecimiento de la célula tumoral de cáncer de ovario disminuye en presencia de la

20 composición.

Expresión del ARNm 756595 en líneas celulares de cáncer

epitelial de ovario

Expresión del ARNm 810612 en líneas celulares de cáncer epitelial de ovario

Validación de la expresión de 250654 en líneas celulares de cáncer epitelial de ovario mediante PCR en tiempo real cuantitativa

Expresión de 250654 en una paciente de cáncer epitelial de ovario no respondedora a lo largo del tiempo

Expresión de la proteína 39093 en extractos de proteína total de líneas celulares de cáncer epitelial de ovario

Expresión del ARNm 39093 en pacientes con

cáncer epitelial de ovario

Expresión del ARNm 809784 en líneas celulares

de cáncer epitelial de ovario

Efectos de cisplatino en células OVCA 429 transfectadas con el ARNip #1

de 39093

Efectos de cisplatino en células OVCA 429 transfectadas con el ARNip #1 de 39093

Análisis por PCR en tiempo real cuantitativa de la expresión del ARNm 250654 en células OVCA 429 transfectadas con diferentes ARNip y controles

Efecto del silenciamiento mediado por ARNip de 250654 sobre la sensibilidad a cisplatino en OVCA 429

Efectos de cisplatino en células OVCA 429 transfectadas con un oligo no transcrito y el ARNip #3 generado contra AF261089

Tratamiento de OVCA 429 con

inhibidor de calpaína I (ALLN) /cisplatino

Efectos de cisplatino en células OVCA 429 transfectadas con el ARNip #3 de BC015973

Expresión de MetAP-2 en ADNc emparejados

de colon normal frente a tumoral

La expresión de 250654 (SPARC) en ADNc emparejados de colon no tumoral frente a tumoral (combinado de dos experimentos separados)

La expresión de 810612 (S100A11) en ADNc emparejados de colon no tumoral frente a tumoral (combinado de dos experimentos separados)

Expresión del gen BC015973 en tejido de colon emparejado (valor medio de carreras duplicadas para cada muestra)

Expresión del gen AF261089 en tejido de colon emparejado (valor medio de carreras duplicadas para cada muestra)

Medida de PCR en tiempo real de la expresión del ARNm del nivel de calpaína 2 o S100A11 en células OVCAR-3 con expresión estable de ARNip específicos contra calpaína 2 o S100A11

Control = células sin ARNip ARNip relevante = células con ARNip estable específico para calpaína 2 o S100A11 ARNip de GFP = células estables con ARNip contra la proteína fluorescente verde como control irrelevante Figura 64