Métodos para la modulación de las vías de metilación del SIRNA y ADN dirigido por ARN.

Un procedimiento para mejorar la resistencia de la planta a un patógeno cuyo procedimiento comprende lamodificación de dicha planta para contener un constructo de ácido nucleico que comprende secuencias decontrol sensibles a patógenos o constitutivas operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos cuyaexpresión aumenta cuando se observa la respuesta de resistencia a dicho patógeno,

en la que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica de la ADN glicosilasaROS1.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Composiciones y métodos para conferir resistencia frente a un amplio espectro de patógenos en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos años ha habido una apreciación creciente de los efectos complejos y pleiotrópicos del silenciamiento génico y los componentes de la maquinaria del silenciamiento génico. A partir de los efectos observados inicialmente por la supresión transgénica de la expresión de genes endógenos en plantas del género petunia, ha surgido una interpretación de los efectos en plantas y animales que abarcan el mantenimiento de control en los transposones de control en el estado de metilación y, en efecto, en la actividad transcripcional de la cromatina.

ARN pequeño. Dícers y Argonautas: núcleo bioquímico del silenciamiento de ARN

“Silenciamiento de ARN” se refiere, en conjunto, a diferentes procesos basados en ARN que tienen como resultado la inhibición específica de secuencia de la expresión génica, ya sea a niveles de transcripción, de estabilidad de ARNm o de traducción. Estos procesos comparten tres características químicas: (i) la formación de ARN (s) bicatenario, (ii) el proceso de ARN en ARNs bicatenarios pequeños de 20 a 60 nucleótidos (nt) con extremos en bisel, y (iii) acción inhibitoria de una hebra de ARN pequeño seleccionado en complejos efectores que actúan en el ARN / ADN parcial o totalmente complementario. Puesto que son numerosos los mecanismos que pueden generar ARN bicatenario, las etapas efectoras y de proceso de ARN pequeño tienen un núcleo bioquímico común. Los ARNs pequeños se producen por enzimas de tipo RNasa III llamadas Dícers1 con uniones de ARN bicatenario, ARN helicasa, RNasa III y dominios PAZ (Piwi / Argonauta / Zwille) . Una de las dos hebras del ARN pequeño se une a complejos efectores llamados RISCs (complejo de silenciamiento inducido por ARN) que contiene invariablemente un miembro de la familia de la proteína Argonauta (Ago) . Los Agos tienen un dominio de unión PAZ al ARN pequeño y también contienen un dominio PIWI que proporciona actividad endonucleolítica (conocida como “slicer”) a los RISCs programados para segmentar los ARNs2, 3 diana. De hecho, el Ago2 humano cargado de ARN pequeño por sí solo constituye un RISC capaz de segmentarse in vitro, pero muchas proteínas adicionales también pueden ser componentes funcionales de los RISCs in vivo4.

En la presente, se analizan pruebas recientes de diferentes vías construidas sobre el núcleo Dícer – Ago que realizan un conjunto de funciones biológicas dirigidas por el ARN pequeño en plantas superiores. Estas incluyen la regulación de la expresión de genes endógenos, el control de transposones, la defensa viral y la formación de heterocromatina. El objetivo principal de la presente se centra en plantas ya que muestran un espectro casi completo de efectos conocidos de silenciamiento de ARN, pero también se incluyen otras similitudes y diferencias con otros organismos.

Vías de silenciamiento de ARN exógenamente desencadenado que dan como resultado el clivaje del transcrito Transgenes productores de ARN bicatenario y IR - SGPT: práctico, pero misterioso [0005] El silenciamiento génico post - transcripcional (SGPT) se descubrió en Petunia transgénica como una pérdida de los loci transgénicos (ya sea en configuración sentido o antisentido) y del gen de expresión homólogo endógeno5. Los loci transgénicos a menudo producían ARN bicatenario ya que formaban conjuntos con patrones de integración complejos6, 7. En consecuencia, la eficacia del SGPT aumentó enormemente por la expresión simultánea de sentido y antisentido o por la producción directa de ARNs bicatenarios largos a partir de transgenes9 colocados como invertidos repetidos (IR) . El último proceso, IR – SGPT, es actualmente la base de ARN de interferencia (ARNi) en plantas, e incluye, al menos, dos clases de ARNs diferentes denominadas ARNs pequeños de interferencia (siRNA) . Se cree que los siRNAs de 21 nt guían el clivaje del ARNm, mientras que los siRNAs de 24 nt pueden mediar exclusivamente las modificaciones de cromatina10, 11. Estas dos clases de siRNA acumulan poblaciones en la secuencia completa de los transcritos de IR12. Aunque se utiliza generalmente como una herramienta de búsqueda, el IR – SGPT sigue siendo uno de los procesos menos conocidos de silenciamiento de ARN de plantas. Un constructo transgén colocado como invertido repetido (IR) , empleado normalmente en el ARNi de plantas, produce transcritos bicatenarios con brazos perfectamente complementarios. Dos enzimas de tipo Dícer (DCL) procesan los transcritos bicatenarios. El DCL3 produce siRNAS de 24 nt, que pueden dirigir la modificación de ADN / histona en los loci homólogos y parece dispensable para el clivaje de ARN. La Figura 3 muestra dos de los numerosos escenarios no excluyentes mutuamente que, posiblemente, explican las modificaciones de cromatina dirigidas al siRNA en los loci endógenos. Cabe destacar que ambos escenarios se basan en esquemas circulares y amplificados en los que la producción de siRNA y la modificación de cromatina se refuerzan entre sí. DCL4 es, probablemente, la enzima preferida para la producción de siRNAs de 21 nt a partir del ARN bicatenario. Una hebra de siRNA se incorpora al RISC cargado con AGO1 para dirigir el clivaje endonucleolítico del ARN homólogo,

conduciéndolo a su degradación. Ambas especies de siRNA se protegen de la degradación añadiendo grupos metilo a los extremos 3' – Terminal de cada hebra de ARN, mediante metiltransferasa HEN1. Por consiguiente, hasta hace poco tiempo, no se había descubierto ningún mutante defectivo en esta vía, a pesar de los esfuerzos considerables de diversos laboratorios. Una de las explicaciones más probables es que los altos niveles de ARN bicatenario producido en IR – SGPT promueve las actividades de los diferentes Dícers y RISCs, que actuarían normalmente en distintas vías, para mediar redundantemente el silenciamiento. Análisis recientes de los knockouts de Dícer combinatorio en Arabidopsis apoya esta idea13, 14. No obstante, el Dícer de tipo 4 (DCL4) parece ser la enzima preferida para el IR – SGPT, ya que se requiere específicamente para la acumulación de siRNA de 21 nt y el silenciamiento a partir de un transgén15 IR moderadamente expresado específico del floema. DCL2 también puede estar involucrado en el ARNi, ya que convierte algunos sustratos de DCL4 endógeno en siRNAs de 22 nt en ausencia de DCL413, 14, aunque no está claro si estas moléculas pueden sustituir funcionalmente los productos de siRNA de 21 nt de DCL4.

S – SGPT y silenciamiento transitivo: introducir RDR

Existen numerosos ejemplos en los que las inserciones de transgenes de copia única producen transcritos de sentido que desencadenan el SGPT. Esta vía, la de (S) – SGPT sentido, se ha analizado minuciosamente utilizando pantallas de genética clásica que presentan cómo se produce el ARN bicatenario. La vía se muestra en la presente siendo mejorada por ARNs con características anormales, aunque puede haber desencadenantes alternativos. Las anormalidades de ARN pueden incluir la falta de una cola poli – A o del capuchón 5'. Este último, normalmente, permitiría la degradación de ARN a través de la actividad de la 5' – 3' exonucleasa XRN4. La falta de XRN4 favorecería la acumulación de ARNm sin capuchón, desencadenando por tanto su conversión en ARN bicatenario por la acción combinada de RDR6, SGS3, SDE3 y, posiblemente, WEX. El ARN bicatenario resultante se procesa a continuación por un DCL, normalmente DCL4 (véase el texto) , produciendo siRNAs únicamente de 21 nt y metilados por HEN1. Estas moléculas pueden tomar parte en dos conjuntos de reacciones. En primer lugar, pueden utilizarse como cebadores por RDR6 para reforzar la producción de ARN bicatenario a partir de plantillas de hebra única en un fenómeno conocido como “transitividad”. En el silenciamiento de ARN transitivo, una fuente de ARN bicatenario de siRNAs primarios favorece la producción de siRNAs 5' y 3' secundarios del intervalo inicialmente dirigido de un transcrito. La producción de siRNAs 5' secundarios (caso 1) puede explicarse por la síntesis de hebra complementaria dependiente de RDR6 / SGS3 / SDE – 3, que se ceba por uno de los siRNAs primarios. La producción de siRNAs 3' secundarios (caso 2) no puede explicarse por una reacción cebadora, y es posible que los fragmentos de ARN resultantes del clivaje de un transcrito dirigido a siRNA primario se reconozcan como anormales, iniciando por tanto la síntesis de ARN bicatenario con un S – SGPT. Las reacciones 5' y 3' no deberían considerarse mutuamente excluyentes, al igual que... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para mejorar la resistencia de la planta a un patógeno cuyo procedimiento comprende la modificación de dicha planta para contener un constructo de ácido nucleico que comprende secuencias de 5 control sensibles a patógenos o constitutivas operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos cuya expresión aumenta cuando se observa la respuesta de resistencia a dicho patógeno, en la que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos que codifica de la ADN glicosilasa ROS1.