Sistemas de expresión de proteínas.

Un sistema de expresión génica que comprende:

(a) una secuencia potenciadora de la expresión derivada del segmento del genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartido de Comoviridae,

en el que se ha mutado un sitio de inicio de traducción en el segmento del genoma de ARN-2, en donde el segmento del genoma del ARN-2 de tipo salvaje del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje; en donde la secuencia potenciadora de la expresión bien:

(i) comprende al menos una secuencia de 200 nucleótidos del segmento del genoma de ARN-2 que incluye el sitio de inicio mutado, o

(ii) tiene al menos una identidad del 70 % con los nucleótidos 1 a 507 del segmento del genoma de ARN-2 de la secuencia de CPMV mostrada en la Tabla 1, y en donde el sitio de inicio en la posición 161 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV de tipo salvaje se ha mutado y

(b) un gen heterólogo que codifica una proteína de interés

en donde el gen que codifica la proteína de interés está situado en dirección 3' de la secuencia potenciadora y está unido operativamente a la secuencia promotora y a la secuencia de terminación.

Sistemas de expresión de proteínas

Campo de la invención La presente invención se refiere de forma general a métodos y materiales, y especialmente secuencias derivadas de virus, para reforzar la expresión génica en plantas y otras células eucariotas, por ejemplo, de genes heterólogos que codifican proteínas de interés.

Antecedentes de la invención Comovirus (CPMV)

Los comovirus son virus de ARN que un genoma bipartido. Los segmentos del genoma de ARN como vírico se denominan ARN-1 y ARN-2. ARN-1 codifica las proteínas replicasa y proteasa de Vpg (Lomonossoff y Shanks, 1983) . El virus necesita la replicasa para la replicación del genoma vírico. El ARN-2 del comovirus virus del mosaico del caupí (CPMV) codifica una proteína de 58K y 48K, así como dos proteínas de la cubierta vírica L y S.

El inicio de traducción del ARN-2 de todos los comovirus se produce en dos puntos de inicio diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, lo que da como resultado dos carboxiproteínas coterminales. Este fenómeno de doble inicio se produce como resultado de un 'escape del barrido ribosómico (leaky scanning) de los ribosomas durante la traducción.

Los codones de inicio del extremo 5' (AUG) del ARN-2 de CPMV se encuentran en las posiciones 115, 161, 512 y

524. Los codones de inicio en las posiciones 161 y 512 están en el mismo marco de lectura del triplete. El inicio en el codón de inicio de la posición 161 da como resultado la síntesis de una poliproteína de 105K mientras que el inicio en el codón de inicio de la posición 512 dirige la síntesis de una poliproteína de 95K. Como la síntesis de ambas poliproteínas finaliza en el mismo codón de detención en la posición 3299, las proteínas 105K y 95K son carboxi coterminales. El codón AUG en la posición 524 puede servir como iniciador si el AUG en 512 se borra. Sin embargo, en presencia del AUG 512, no realiza esta función y simplemente codifica el aminoácido metionina (Holness et al., 1989; Wellink et al., 1993) . El codón de inicio en posición 115 no es fundamental para la replicación del virus (Wellink et al., 1993) .

Las proteínas de 105K y 95K codificadas por el genoma ARN-2 de CPMV son productos de traducción primaria que posteriormente se escinden mediante la actividad proteolítica codificada por ARN-1 para producir la proteína de 58K

o bien la proteína de 48K, dependiendo de si la poliproteína que se está procesando es de 105K o 95K, y las dos proteínas víricas de la cubierta, L y S. El inicio de traducción en el codón de inicio en la posición 512 en CPMV es más eficaz que el inicio en la posición 161, lo que da como resultado la producción de más poliproteína de 95K que de poliproteína de 105K.

El codón de inicio en la posición 115 en el ARN-2 de CPMV se encuentra en dirección 5' de los sitios de inicio en las posiciones 161 y 512 y se encuentra en un marco de lectura diferente. Puesto que este codón de inicio está en fase con un codón de detención en la posición 175, el inicio en este sitio podría dar como resultado la producción de un péptido de 20 aminoácidos. Sin embargo, hasta el momento no se ha detectado la producción de dicho péptido.

Necesidad de mantener el marco entre AUG

Los experimentos de mutagénesis han mostrado que el mantenimiento del marco entre los sitios de inicio en las posiciones 161 y 512 del ARN-2 de CPMV es esencial para una replicación eficaz de ARN-2 mediante la replicasa codificada por ARN-1 (Holness et al., 1989; van Bokhoven et al., 1993; Rohll et al., 1993; Wellink et al., 1993) . Este requisito restringe la longitud de las secuencias que se pueden insertar en dirección 5' del codón de inicio 512 en vectores de expresión basados en ARN-2 de CPMV (véase más adelante) , haciendo que la clonación de genes extraños en dichos vectores sea más difícil de lo que sería ideal. Por ejemplo, impide el uso de polienlazadores, ya que el uso de estos frecuentemente altera el marco de lectura abierto (ORF) entre estos sitios de inicio.

Vectores CPMV

CPMV ha servido como base para el desarrollo de sistemas vectores adecuados para la producción de polipéptidos heterólogos en planteas (Liu et al., 2005; Sainsbur y et al., 2007) . Estos sistemas están basados en la modificación del ARN-2 pero difieren en si se usan versiones de longitud completa o borradas. En ambos casos, sin embargo, la replicación del ARN-2 modificado se consigue mediante la inoculación simultánea con ARN-1. Los sistemas de expresión basados en una versión del ARN-2 de longitud completa implican la fusión de la proteína extraña con el extremo C de las poliproteínas derivadas del ARN-2. La liberación del polipéptido del extremo N está mediada por la acción de la secuencia del péptido catalítico 2A procedente del virus de la enfermedad de manos y pies (Gopinath et al., 2000) . Las moléculas de ARN-2 resultantes pueden diseminarse en una planta y también entre plantas. Esta estrategia se ha utilizado para expresar numerosas proteínas recombinantes, tal como el antígeno principal de la hepatitis B (HBcAg) y proteínas inmunes pequeñas (SIP) , en plantas de caupí (Mechtcheriakova et al., 2006; Monger et al., 2006; Alamillo et al., 2006) . Aunque ha tenido éxito, el uso de un vector vírico de longitud completa tiene desventajas en términos limitaciones de tamaño de las secuencias insertadas y preocupaciones sobre bioconfinamiento.

Para resolver esto, se ha desarrollado recientemente una versión borrada del ARN-2 de CPMV (Cañizares et al., 2006) . En este sistema, se han eliminado la región del ARN-2 que codifica la proteína del movimiento y ambas proteínas de la cubierta. Sin embargo, las moléculas borradas siguen teniendo las secuencias de acción en cis necesarias para su replicación mediante la replicasa codificada por ARN-1 y de esta forma se mantienen niveles elevados de amplificación génica sin la posibilidad concomitante de que el virus modificado contamine el medio ambiente. Con la inclusión de un supresor del silenciamiento génico, tal como HcPro de PVY, (Brigneti et al., 1998) en el inóculo además del ARN-1, el vector CPMV borrado se puede usar como un sistema de expresión transitoria (documento WO/2007/135480) Bipartite System, Method And Composition For The Constitutive And Inducible Expression Of High Levels Of Foreign Proteins In Plants; también Sainsbur y et al., 2009) . Sin embargo, a diferencia de la situación con un vector basado en el ARN-2 de longitud completa, la replicación queda restringida a las hojas inoculadas. Estos vectores de CPMV se han utilizado para expresar complejos multicadena que consisten en un solo tipo de polipéptido.

También se ha demostrado que múltiples copias de vectores basados bien en las versiones de longitud completa o en versiones borradas del ARN-2 de CPMV son adecuadas para la producción de proteínas heteroméricas en plantas (Sainsbur y et al., 2008) . Se ha utilizado la infiltración simultánea de dos construcciones de ARN-2 de longitud completa que incluyen diferentes genes marcadores en Nicotiana benthamiana en presencia de ARN-1 para mostrar que dos proteínas extrañas se pueden expresar eficazmente dentro de la misma célula en tejido inoculado. Además, las proteínas se puede localizar simultáneamente en los mismos compartimentos subcelulares, que es un prerrequisito esencial de la formación de heterómeros.

También se ha investigado la adecuabilidad de los diferentes vectores de ARN-2 de CPMV para la expresión de proteínas heteroméricas en plantas. La inserción de las cadenas ligera y pesada de una IgG en las versiones de ARN-2 tanto de longitud completa como borrada demostró que ambos enfoques conducían a la acumulación de moléculas de IgG de longitud completa en el tejido inoculado, pero que los niveles eran considerablemente mayores cuando se usaban vectores de ARN-2 borrados. La capacidad de las construcciones de ARN-2 de longitud completa para diseminarse sistémicamente parece, por tanto, ser irrelevante para la producción de proteínas heteroméricas, y el uso de versiones de ARN-2 borradas es claramente ventajoso, especialmente porque también ofrecen la ventaja del bioconfinamiento.

Por tanto, los sistemas vectores conocidos basados en CPMV representan herramientas útiles para la expresión de un gen heterólogo que codifica una proteína de interés en plantas. Sin embargo, sigue existiendo necesidad en la técnica de sistemas vectores óptimos para mejorar, por ejemplo, el rendimiento de las proteínas heterólogas expresadas y la facilidad de uso del vector.

Sumario de la invención Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la mutación del codón de inicio en la posición 161 de un vector... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de expresión génica que comprende:

(a) una secuencia potenciadora de la expresión derivada del segmento del genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartido de Comoviridae, en el que se ha mutado un sitio de inicio de traducción en el segmento del genoma de ARN-2, en donde el segmento del genoma del ARN-2 de tipo salvaje del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje; en donde la secuencia potenciadora de la expresión bien:

(i) comprende al menos una secuencia de 200 nucleótidos del segmento del genoma de ARN-2 que incluye el sitio de inicio mutado, o

(ii) tiene al menos una identidad del 70 % con los nucleótidos 1 a 507 del segmento del genoma de ARN-2 de la secuencia de CPMV mostrada en la Tabla 1, y en donde el sitio de inicio en la posición 161 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV de tipo salvaje se ha mutado y

(b) un gen heterólogo que codifica una proteína de interés en donde el gen que codifica la proteína de interés está situado en dirección 3' de la secuencia potenciadora y está unido operativamente a la secuencia promotora y a la secuencia de terminación.

2. Un sistema de expresión génica que comprende una construcción de expresión génica que comprende:

(a) una secuencia potenciadora de la expresión derivada del segmento del genoma de ARN-2 de un virus de ARN bipartido de Comoviridae, en el que se ha mutado un sitio de inicio en el segmento del genoma de ARN-2, en donde el segmento del genoma del ARN-2 de tipo salvaje del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del virus del mosaico del caupí (CPMV) de tipo salvaje, en donde la secuencia potenciadora de la expresión bien:

(i) comprende al menos una secuencia de 200 nucleótidos del segmento del genoma de ARN-2 que incluye el sitio de inicio mutado, o

(ii) tiene al menos una identidad del 70 % con los nucleótidos 1 a 507 del segmento del genoma de ARN-2 de la secuencia de CPMV mostrada en la Tabla 1, y en donde el sitio de inicio en la posición 161 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV de tipo salvaje se ha mutado; y

(b) una secuencia heteróloga para facilitar la inserción de un gen que codifica una proteína de interés en el sistema de expresión génica, en donde la secuencia heteróloga está situada en dirección 3' del sitio de inicio mutado en la secuencia potenciadora; y opcionalmente,

(c) una UTR en 3'.

3. Un sistema de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2 que comprende o que comprende además una UTR en 3' que se deriva opcionalmente del mismo virus de ARN bipartido.

4. Un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el virus de ARN bipartido es un comovirus, en donde el comovirus es opcionalmente un CPMV.

5. Un sistema de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la secuencia potenciadora comprende al menos los nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 511, 1 a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507 o 150 a 507 de una secuencia del segmento del genoma de ARN-2 del comovirus con dicho sitio de inicio diana mutado.

6. Un sistema de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 5 en el que la secuencia potenciadora comprende los nucleótidos 10 a 512, 20 a 512, 30 a 512, 40 a 512, 50 a 512, 100 a 512, 150 a 512, 1 a 514, 10 a 514, 20 a 514, 30 a 514, 40 a 514, 50 a 514, 100 a 514, 150 a 514, 1 a 511, 10 a 511, 20 a 511, 30 a 511, 40 a 511, 50 a 511, 100 a 511, 150 a 511, 1 a 509, 10 a 509, 20 a 509, 30 a 509, 40 a 509, 50 a 509, 100 a 509, 150 a 509, 1 a 507, 10 a 507, 20 a 507, 30 a 507, 40 a 507, 50 a 507, 100 a 507 o 150 a 507 de la secuencia del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV mostrada en la Tabla 1, en el que el sitio de inicio en la posición 161 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV de tipo salvaje se ha mutado.

7. Un sistema de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la secuencia potenciadora tiene al menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 % o 75 % de identidad con la secuencia del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV mostrado en la Tabla 1, en donde el sitio de inicio en la posición 161 del segmento del genoma de ARN-2 de CPMV de tipo salvaje se ha mutado.

8. Un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 que comprende:

(a) un promotor;

(b) nucleótidos 1 a 507 de la secuencia del segmento del genoma de ARN-2 del virus del mosaico del caupí mostrada en la Tabla 1, en donde el AUG en la posición 161 se ha mutado como se muestra en la Tabla 2, situada en dirección 3' del promotor;

(c) un gen que codifica una proteína de interés situada en dirección 3' de la secuencia definida en (b) ;

(d) nucleótidos 3302 a 3481 de la secuencia del segmento del genoma de ARN-2 del virus del mosaico del caupí mostrada en la Tabla 1, situada en dirección 3' del gen que codifica la proteína de interés; y

(e) un terminador de la nopalina sintasa situado en dirección 3' de la secuencia definida en (d) , o que comprende:

(a) un promotor;

(b) una secuencia potenciadora de la expresión que tiene al menos una identidad del 70 % con los nucleótidos 1 a 507 del segmento del genoma de ARN-2 de la secuencia de CPMV del virus del mosaico del caupí mostrada en la Tabla 1, en donde el AUG en la posición 161 se ha mutado, situada en dirección 3' del promotor;

(c) un gen que codifica una proteína de interés situada en dirección 3' de la secuencia definida en (b) ;

(d) nucleótidos 3302 a 3481 de la secuencia del segmento del genoma de ARN-2 del virus del mosaico del caupí mostrada en la Tabla 1, situada en dirección 3' del gen que codifica la proteína de interés; y

(e) un terminador de la nopalina sintasa situado en dirección 3' de la secuencia definida en (d) .

9. Un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el virus de ARN bipartido es un CPMV, y el AUG en la posición 115 también está mutado.

10. Un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 que comprende:

(a) una primera construcción génica que comprende una secuencia derivada de un ARN-2 truncado de un genoma de un virus bipartido Comoviridae que incluye al menos un gen extraño que codifica una proteína heteróloga de interés unida operativamente a secuencias promotoras y de terminación, en donde la construcción génica comprende el sitio de inicio mutado en dirección 5' del gen extraño, en donde el segmento del genoma del ARN-2 del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje; y opcionalmente,

(b) una segunda construcción génica incorporada opcionalmente en dicha primera construcción génica que comprende un supresor heterólogo del silenciamiento génico unido operativamente a secuencias promotoras y de terminación.

11. Un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un vector binario de ADN.

12. Un proceso para aumentar la expresión o potenciar la actividad traduccional de una secuencia derivada de un segmento derivado del genoma de ARN-2 de un virus bipartido Comoviridae, que comprende la mutación de un sitio de inicio en el mismo, en donde el segmento del genoma del ARN-2 del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje, en donde dicha mutación se realiza mediante:

(i) una mutación puntual en el sitio de inicio, o

(ii) una deleción de hasta 50 nucleótidos de longitud que incluye dicho sitio de inicio,

en donde dicha mutación potencia la expresión de un ORF heterólogo al que está unida la secuencia.

13. Un método para expresar una proteína heteróloga de interés en un organismo hospedador usando un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el organismo hospedador es un hospedador eucariota, que es opcionalmente una planta o un insecto.

14. Un método para potenciar la traducción de una proteína heteróloga de interés a partir de un gen o de un marco de lectura abierto (ORF) que codifica el mismo, que está unido operativamente a un segmento de genoma de ARN-2

de una secuencia derivada de un virus bipartido Comoviridae , en donde el segmento del genoma del ARN-2 del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, que comprende mutar el primero de estos dos sitios de inicio en la secuencia derivada de ARN-2, en donde el sitio de inicio mutado corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje, en donde dicha mutación se realiza mediante:

(i) una mutación puntual en el sitio de inicio, o

(ii) una deleción de hasta 50 nucleótidos de longitud que incluye dicho sitio de inicio.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, para expresar una proteína heteróloga en una planta, que comprende las etapas de:

(a) . introducir una construcción de expresión génica que comprende una primera construcción génica que comprende una secuencia derivada de un ARN-2 truncado de un genoma de un virus bipartido Comoviridae que incluye al menos un gen extraño que codifica una proteína heteróloga de interés unida operativamente a secuencias promotoras y de terminación, en donde la construcción génica comprende un sitio de inicio mutado en dirección 5' del gen extraño en una célula vegetal, en donde el segmento del genoma del ARN-2 del virus Comoviridae codifica dos carboxiproteínas coterminales a través de dos sitios de inicio de traducción diferentes situados en el mismo marco de lectura del triplete, en donde el sitio de inicio mutado es el primero de estos dos sitios de inicio y corresponde al sitio de inicio en la posición 161 en el segmento de ARN-2 del CPMV de tipo salvaje; y opcionalmente,

(b) introducir una segunda construcción génica que opcionalmente se incorpora en dicha primera construcción génica, que comprende un supresor del silenciamiento génico unido operativamente a secuencias promotoras y de terminación en la célula vegetal.

16. Un organismo hospedador transfectado transitoriamente con, y que comprende, un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el organismo hospedador es opcionalmente una planta o una célula vegetal.

17. Un organismo hospedador transgénico transformado de forma estable con, y que comprende, un sistema de expresión génica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.