Método y kit para detectar si un individuo es susceptible a progresar hasta una enfermedad micobacteriana activa.

Un método para detectar si un individuo progresará hasta tener enfermedad micobacteriana activa quecomprende determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra uno o más de los siguientes antígenosmicobacterianos:

- CFP-10,

- Rv3873, o

- Rv3878.

Método y kit para detectar si un individuo es susceptible a progresar hasta una enfermedad micobacteriana activa Campo de la invención La invención se refiere a un método pronóstico.

Antecedentes de la invención El ensayo cutáneo de tuberculina (TST) ha sido hasta ahora el único marcador pronóstico para tuberculosis activa (TB) en personas con reciente exposición a TB. Las reacciones de ensayo cutáneo más grandes a tuberculina se asocian con índices crecientes de posterior progreso a tuberculosis activa. Sin embargo, la fiabilidad pronóstica del TST en poblaciones vulnerables, tales como niños jóvenes, puede estar reducida. La aplicación del ensayo cutáneo también tiene limitaciones logísticas; por ejemplo, la necesidad de una nueva visita de 3 a 7 días después para leer el resultado y la subjetividad en el registro de la cantidad de endurecimiento cutáneo.

Sumario de la invención Los presentes inventores han demostrado que respuestas de células T a antígenos micobacterianos particulares actúan como marcadores pronóstico que pueden usarse para identificar a individuos en riesgo de progresar hasta enfermedad micobacteriana activa. Este hallazgo se usa como base del método pronóstico de la invención.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar si un individuo progresará hasta tener 25 enfermedad micobacteriana activa que comprende determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra uno o más de los siguientes antígenos micobacterianos:

- CFP-10, -Rv3873, o -Rv3878.

La invención también proporciona el uso del método pronóstico de la invención de una lista que comprende un medio para determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra uno o más de los siguientes antígenos micobacterianos:

- CFP-10, -Rv3873 o -Rv3878.

Breve descripción del dibujo La Figura 1 muestra un diagrama de flujo para el estudio descrito en los Ejemplos.

Breve descripción de las secuencias 45 SEC ID Nº 1 es la secuencia de aminoácidos del antígeno ESAT-6 de Mycobacterium tuberculosis. SEC ID Nº 2 es la secuencia de aminoácidos del antígeno CPF10 de Mycobacterium tuberculosis. SEC ID Nº 3 es la secuencia de aminoácidos del antígeno Rv1989c de Mycobacterium tuberculosis. SEC ID Nº 4 es la secuencia de aminoácidos del antígeno Rv3873 de Mycobacterium tuberculosis. SEC ID Nº 5 es la secuencia de aminoácidos del antígeno Rv3878 de Mycobacterium tuberculosis. SEC ID Nº 6 es la secuencia de aminoácidos del antígeno Rv3879c de Mycobacterium tuberculosis. ES1 a ES17 son las secuencias de aminoácidos de una combinación de 17 péptidos derivados de ESAT-6. cfp10/1 a cfp10/18 son las secuencias de aminoácidos de una combinación de 18 péptidos derivados de CFP

10.

NEW POOL 1 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv3873. NEW POOL 3 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv3873. NEW POOL 4 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 7 péptidos derivados de Rv3878. NEW POOL 5 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 7 péptidos derivados de Rv3878. NEW POOL 6 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv3879c.

NEW POOL 7 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv3879c.

NEW POOL 8 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 5 péptidos derivados de Rv3879c. NEW POOL 9 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv1989c.

NEW POOL 10 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv1989c. NEW POOL 11 enumera las secuencias de aminoácidos de una combinación de 6 péptidos derivados de Rv1989c.

Descripción detallada de la invención La invención proporciona un método para detectar si un individuo progresará hasta tener enfermedad micobacteriana activa. En una realización preferida dicha enfermedad micobacteriana está causada por Mycobacterium tuberculosis.

El individuo es típicamente un mamífero, preferiblemente un ser humano. El individuo es típicamente uno que no tiene ningún síntoma de una infección micobacteriana. El individuo puede dar positivo o negativo en un ensayo de Mantoux. El individuo puede estar en riesgo de infección micobacteriana, típicamente por razones socioeconómicas o puede tener una predisposición genética o adquirida a infección micobacteriana.

El individuo puede ser un "contacto" conocido o sospechoso que ha estado expuesto a o puede haber estado expuesto a Mycobacterium tuberculosis. Típicamente la exposición es a tuberculosis pulmonar, tal como tuberculosis pulmonar "abierta" que es positiva en frotis de esputo A.F.B. (bacilo acidorresistente) . El contacto puede ser alguien cuya exposición es en casa, el lugar de trabajo (tal como un trabajador de asistencia sanitaria) o exposición en prisiones (tal como un prisionero) . La exposición puede haber sido el resultado de residir en un país con elevada prevalencia de TB, y en una realización el método pronóstico se realiza después de emigración a un país con una baja prevalencia de TB. Por tanto el individuo puede ser un inmigrante.

El individuo (por ejemplo, que tiene una exposición reciente o remota conocida o sospechosa) puede estar sano, puede tener una co-infección o una afección crónica o estar con agentes terapéuticos que le ponen en un riesgo mayor de desarrollar TB activa y/o que puede hacer que la infección por TB sea más difícil de diagnosticar. Los ejemplos incluyen individuos infectados por VIH, individuos que toman inmunosupresores (por ejemplo, corticosteroides, azatioprina y agentes anti-TNF-!, tales como infliximab, y terapia contra el cáncer) , pacientes de hemodiálisis, receptores de trasplantes de órganos, diabéticos y niños muy pequeños (con edades por debajo de 5

años, particularmente por debajo de 2 años) .

El método de la invención se refiere a la determinación de si un individuo tiene una respuesta de células T contra antígenos particulares. Esto puede determinarse por cualquier método adecuado, por ejemplo cualquier método que pueda usarse para detectar la presencia de células T expuestas a antígeno. En una realización se determina midiendo el nivel de células T específicas contra el antígeno o antígenos. Puede determinarse determinando si las células T del individuo reconocen el antígeno o antígenos.

Las células T que reconocen el antígeno en el método son generalmente células T que se han pre-sensibilizado in vivo contra el antígeno de una micobacteria. Estas células T expuestas a antígeno están generalmente presentes en 45 la sangre periférica de un individuo que se ha expuesto a una micobacteria a una frecuencia de 1 en 106 a 1 en 103 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . Las células T pueden ser células T CD4 y/o CD8.

En el método, las células T pueden ponerse en contacto con el antígeno in vitro, preferiblemente in vitro en una muestra del individuo.

Generalmente las células T que se ponen en contacto en el método se toman del individuo en una muestra sanguínea, aunque pueden usarse otros tipos de muestra que contengan células T. La muestra puede añadirse directamente al ensayo o puede procesarse primero. Típicamente el procesamiento puede comprender diluir la muestra, por ejemplo con agua, tampón o medio. Típicamente la muestra se diluye de 1, 5 a 100 veces, por ejemplo 55 de 2 a 50 o de 5 a 10 veces.

El procesamiento puede comprender la separación de los componentes de la muestra. Típicamente las células mononucleares (MC) se separan de las muestras. Las MC comprenderán las células T y las células presentadoras de antígeno (APC) . Por tanto, en el método, las APC presentes en las MC separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra realización solamente las células T, tales como solamente las células T CD4, pueden purificarse de la muestra. Las PBMC, MC y células T pueden separarse de la muestra usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas en Lalvani et al. (1997) J. Exp. Med. 186, pág. 859-865.

Preferiblemente, las células T usadas en el ensayo están en forma de muestras no procesadas o diluidas, son 65 células T recién aisladas (tales como en forma de MC o PBMC recién aisladas) que se usan directamente ex vivo, en decir, no se cultivan antes de usarse en el método o son células descongeladas (que se congelaron previamente) . Sin embargo, las células T pueden cultivarse antes de su uso, por ejemplo en presencia del antígeno, y generalmente... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar si un individuo progresará hasta tener enfermedad micobacteriana activa que comprende determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra uno o más de los siguientes antígenos 5 micobacterianos:

- CFP-10, -Rv3873, o -Rv3878.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 donde la determinación de si el individuo tiene una respuesta de células T contra el antígeno micobacteriano se realiza evaluando:

-si las células T del individuo reconocen dicho antígeno micobacteriano, y/.

15. el nivel de células T que son específicas para dicho antígeno micobacteriano en una muestra del individuo.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra 2, 3, 4 o todos los siguientes: ESAT-6, CFP-10, Rv3873 o Rv3878.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra ESAT-6 y CFP-10.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde las células T del individuo

se ponen en contacto con un péptido que comprende un epítopo de células T de ESAT-6, CFP-10, Rv3873 o 25 Rv3878; y se evalúa la respuesta de las células T contra el péptido.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende la determinación del reconocimiento por células T de un péptido que comprende la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, o SEC ID Nº 6, o un homólogo de una de dichas secuencias que es al menos un 70% homólogo al mismo.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende la determinación del reconocimiento por células T de un fragmento y/u homólogo de ESAT-6, CFP-10, Rv3873 o Rv3878, donde dicho fragmento y/u homólogo es capaz de reconocerse mediante una célula T que reconoce un epítopo de células T de ESAT-6, CFP-10, Rv3873 o Rv3878.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde las células T están presentes en una muestra del individuo, y

- todos los péptidos que tienen que ensayarse se proporcionan simultáneamente en la muestra, y/o -menos de 20, y preferiblemente menos de 10, péptidos diferentes se proporcionan en la muestra, y/o -al menos 1 ó 2 péptidos de 2 o más de: ESAT-6, CFP-10. Rv3873 y Rv3878, se proporcionan en la muestra.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el reconocimiento por las

células T se mide por detección de la producción de una citoquina en la célula T y/o la secreción de una citoquina de 45 la célula T.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 donde la detección de la citoquina se realiza usando anticuerpos contra la citoquina, donde los anticuerpos están opcionalmente inmovilizados y/o la citoquina es opcionalmente IFN-#

o IL-2.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde las células T que se ensayan son células T recién aisladas (no cultivadas) o células T después de congelarse.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las células T que se ensayan se 55 han cultivado in vitro.

13. Uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes de un kit que comprende un medio para determinar si el individuo tiene una respuesta de células T contra uno o más de los siguientes antígenos micobacterianos:

- CFP-10, -Rv3873, o -Rv3878.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, donde el kit comprende adicionalmente uno o más péptidos de CFP-10, Rv3873 y/o Rv3878.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 o reivindicación 14, donde el kit comprende adicionalmente anticuerpos contra IFN-# o IL-2 inmovilizados en un soporte sólido, y/o péptidos de ESAT-6.