Método para producir plantas estériles masculinas.

Un método para producir plantas estériles masculinas mediante la expresión del gen BECLIN 1 vegetal en lacapa del tapete de las anteras durante las primeras etapas del desarrollo del polen.

Método para producir plantas estériles masculinas Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para producir plantas estériles masculinas. En particular, esta invención se refiere a la transformación de una planta con una construcción genética que comprende el gen BECLIN 1 vegetal, y la expresión de este gen en el tapete de las anteras produce una planta transgénica estéril masculina. Las plantas estériles masculinas son útiles para la producción de plantas híbridas mediante hibridación sexual. El desarrollo de variedades cultivadas híbridas es muy deseable debido a su productividad generalmente incrementada debido a un vigor híbrido o heterosis incrementada.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Las plantas híbridas se han hecho cada vez más importantes en diversos cultivos de alimentos comerciales en todo el mundo. Las plantas híbridas tienen la ventaja de un mayor rendimiento, mejor calidad y resistencia a agresiones que sus progenitores, debido a la heterosis o vigor híbrido. La uniformidad de los cultivos es otra ventaja de las plantas híbridas cuando los progenitores son homocigotos; esto conduce a una gestión mejorada de los cultivos. La semilla híbrida, por lo tanto, es comercialmente importante y se vende a un precio más elevado. En cultivos tales como maíz, girasol, sorgo, remolacha azucarera, algodón, y muchas hortalizas, los híbridos representan una gran proporción del mercado de semillas. No solamente los EE.UU. y Europa, sino también muchos países en desarrollo basan su producción de alimentos en gran medida en los híbridos. La venta de híbridos en los diversos cultivos representa casi un 40 por ciento del negocio global de semillas comerciales de alrededor de 15.000 millones de dólares. Es probable que esta proporción se incremente, ya que todavía se tiene que comprender completamente la importancia del vigor híbrido, especialmente en los países en desarrollo.

La producción de variedades híbridas de maíz (desde los años treinta en los EE.UU.) , algodón (desde 1970 en India) y de arroz (desde 1976 en China) representa el esfuerzo de mejora vegetal más significativo y eficaz del siglo veinte. Se observó un incremento del 600% entre 1930 y 1990 en la producción de maíz en EE.UU. tras la introducción de la mejora vegetal híbrida, en comparación con los rendimientos uniformes para las poblaciones seleccionadas con polinización libre durante los 60 años anteriores (Stuber, 1994) .

El concepto de vigor híbrido (Zirkle, 1952) surgió desde las primeras observaciones en el siglo dieciocho de J.G. Koelreuter de cruces interespecíficos en Nicotiana, Dianthus, Verbascum, Mirabilis, Datura, confirmadas por Darwin (Darwin, 1876) en hortalizas, y W.J. Beal en maíz (Beal, 1880) . Posteriormente, este efecto se aprovechó en la mejora vegetal (Shull, 1952) cuando aparecieron las herramientas para producir la cantidad necesaria de semillas en especies hermafroditas: el primer sistema de esterilidad masculina se desarrolló en cebolla en 1943 (Jones, 1943) y otros se desarrollaron en una amplia diversidad de especies tales como remolacha azucarera, maíz, sorgo, girasol, arroz, semilla de colza, y zanahoria (Frankel, 1977) .

La clave de la producción comercial eficaz de semillas híbridas es el control suficiente del proceso de polinización que es la esterilidad masculina. La esterilidad masculina se define como la incapacidad de las plantas de producir anteras funcionales, polen, o gametos masculinos. La primera documentación de la esterilidad masculina apareció en 1763 cuando Koelreuter observó el aborto de las anteras en especies e híbridos específicos. El maíz tiene flores masculinas y femeninas claramente diferentes que hacen que la planta sea muy adecuada para la emasculación manual o mecánica. Las espigas se eliminan de las plantas de semillas antes de que puedan esparcir polen. Aunque la eliminación de las espigas se usa actualmente en la producción de semillas híbridas para plantas tales como el maíz, el proceso es laborioso y costoso, tanto con respecto al coste de la eliminación propiamente dicha de las espigas como con respecto a la pérdida de rendimiento como resultado de la eliminación de las espigas del progenitor femenino.

La mayoría de las plantas de cultivo de interés tienen ambos órganos masculinos y femeninos funcionales en la misma flor, y, por lo tanto, la emasculación no es un procedimiento simple. Aunque es posible eliminar manualmente los órganos que forman el polen antes de que se esparza el polen, esta forma de producción de híbridos es extremadamente laboriosa y cara. Las semillas se producen de esta manera solamente si el valor y la cantidad de semillas recuperadas garantizan el esfuerzo.

Otros medios generales para producir semillas híbridas es usar productos químicos que destruyen o bloquean la formación de polen viable. Estos productos químicos, denominados gametocidas, se usan para conferir una esterilidad masculina transitoria. La producción comercial de semillas híbridas mediante el uso de gametocidas está limitada por el coste y la disponibilidad de los productos químicos y la fiabilidad y la duración de la acción de las aplicaciones. Una limitación grave de los gametocidas es que tienen efectos fitotóxicos, cuya gravedad depende del genotipo. Otras limitaciones incluyen que estos productos químicos pueden no alcanzar de manera eficaz las zonas reproductivas masculinas, o pueden no ser eficaces para cultivos con un periodo de floración prolongado, porque las flores nuevas producidas pueden no verse afectadas. Por lo tanto, es necesaria la aplicación repetida de los productos químicos.

Muchos sistemas de producción de semillas híbridas comerciales actuales para cultivos de campo se basan en un medio genético de control de la polinización. Las plantas que se usan como hembras no pueden producir polen, no pueden esparcir el polen, o producen polen que es bioquímicamente incapaz de llevar a cabo la auto-fertilización. Los sistemas de control del polen basados en mecanismos genéticos que provocan esterilidad masculina tienen un interés más generalizado para la producción comercial de semillas. Existen tres tipos principales de esterilidad masculina observados en la naturaleza. Los tres tipos de esterilidad masculina se usan en los programas comerciales de mejora vegetal para asegurar una polinización cruzada para producir semillas híbridas en diferentes cultivos.

Un tipo de esterilidad masculina es la codificada nuclear denominada esterilidad masculina genética. Está controlada normalmente por un único gen recesivo, ms, pero también se conocen genes dominantes que controlan la esterilidad masculina, p.ej. en girasol. Así, la esterilidad masculina nuclear puede ser dominante o recesiva. Se han aislado muchos genes de esterilidad masculina (ms) nucleares diferentes en maíz. En arroz se conocen 25 ms. En una planta homocigota recesiva para tal gen, el polen no puede desarrollarse hasta la madurez. Para fines de mejora vegetal, una planta progenitora estéril masculina recesiva se mantiene cruzándola con una planta fértil masculina heterocigota que también incluye el alelo de esterilidad masculina recesiva, de forma que la descendencia consiste en un 50% de plantas estériles masculinas recesivas. El otro 50% son plantas fértiles masculinas que se tienen que descartar en programas de cruce exogámico que solamente se pueden llevar a cabo con eficacia si el alelo de esterilidad masculina recesiva se segrega junto con un marcador seleccionable o cribable. En la patente de EE.UU.

4.727.219 se describe un procedimiento para el uso de la esterilidad masculina recesiva para la producción de maíz híbrido. Las plantas estériles masculinas nucleares dominantes, en comparación con las plantas estériles masculinas recesivas, se pueden mantener por medio del cruce con una planta fértil masculina, para producir una descendencia que consiste en un 50% de plantas estériles masculinas dominantes. La utilidad de la planta estéril masculina nuclear dominante, sin embargo, es limitada debido a que su alelo de esterilidad masculina dominante en la mayoría de los casos no está asociado estrechamente (es decir, dentro del mismo locus genético) a un marcador seleccionable o cribable. La esterilidad dominante se puede usar solamente para la formación de semillas híbridas si es posible la propagación de la línea femenina (por ejemplo, por medio de la propagación clonal in vitro) . Se desarrollaron líneas estériles masculinas nucleares dominantes con un marcador de semillas azul en trigo candeal y trigo común (Tian y Liu, 2001) . Esta esterilidad masculina genética es de existencia generalizada en plantas, pero la utilidad comercial de este sistema de esterilidad es... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir plantas estériles masculinas mediante la expresión del gen BECLIN 1 vegetal en la capa del tapete de las anteras durante las primeras etapas del desarrollo del polen.

2. El método según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a. separar la tercera y cuarta hojas de la roseta de plantas de Arabidopsis thaliana de alrededor de 3 semanas de edad y ponerlas flotando sobre agua desionizada en placas de Petri, con el lado adaxial hacia arriba;

b. incubar las hojas de la roseta obtenidas en la etapa (a) a 22 ± 1 °C en la oscuridad durante alrededor de 48 horas para inducir artificialmente la autofagia;

c. extraer el ARN total de las hojas a las que se indujo la autofagia obtenidas en la etapa (b) ; 10 d. preparar el cADN a partir del ARN total extraído en la etapa (c) ;

e. amplificar el gen BECLIN 1/ATG6 vegetal a partir del cADN preparado en la etapa (d) mediante el uso de cebadores específicos del gen mediante PCR;

f. clonar el gen BECLIN 1/ATG6 amplificado obtenido en la etapa (e) en un vector;

g. construir un casete de expresión mediante fusión génica entre un promotor específico del tapete que tiene

la SEQ ID Nº: 3 y el gen BECLIN 1/ATG6 vegetal que tiene la SEQ ID Nº: 1 obtenido de la etapa (f) y la secuencia terminadora Nos en un vector de clonación;

h. sub-clonar el casete de expresión como se construyó en la etapa (g) en un vector binario;

i. introducir el vector binario resultante de la etapa (h) , que porta dicho casete de expresión, en Agrobacterium tumefaciens;

j. transformar la planta en la que se va a inducir la esterilidad masculina con la Agrobacterium tumefaciens recombinante obtenida en la etapa (i) ; y

k. desarrollar líneas transgénicas independientes.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la transformación se lleva a cabo en plantas seleccionadas de un grupo que consiste en tabaco, algodón, arroz, trigo, maíz, patata, tomate, colza, alfalfa, girasol, cebolla, trébol, soja, 25 y guisante.

4. Un vector recombinante útil para inducir la esterilidad masculina en plantas mediante transformación que comprende:

i) un promotor específico de la antera, en el que dicho promotor específico de la antera usado es un promotor específico del tapete, representado por SEQ ID Nº: 3;

ii) un gen BECLIN 1 vegetal en el que dicho gen tiene la secuencia SEQ ID Nº: 1 y codifica un polipéptido que tiene SEQ ID Nº: 2 o su homólogo; y

iii) una secuencia terminadora Nos.

5. El vector recombinante según la reivindicación 4, en el que el casete de expresión que comprende una fusión génica quimérica entre el promotor específico del tapete y el gen BECLIN 1/AGT6 vegetal tiene la secuencia 35 polinucleotídica representada por SEQ ID Nº: 4.

6. Una planta, célula, o tejido que comprende un vector recombinante de la reivindicación 5.

7. El uso del método según la reivindicación 1 para inducir la esterilidad masculina en plantas seleccionadas del grupo de las plantas enumeradas en la reivindicación 3.

8. El uso del vector recombinante según la reivindicación 4, para inducir la esterilidad masculina en plantas 40 seleccionadas del grupo de las plantas enumeradas en la reivindicación 3.

9. Un equipo para inducir la esterilidad masculina en plantas que consiste en:

a. un vector que tiene un promotor específico del tapete de SEQ ID Nº: 3 y un gen BECLIN 1 vegetal;

b. reactivos adecuados; y

c. manual de instrucciones. 45

Pólenes de las plantas de control Pólenes de las plantas transgénicas

Figura 1. Ensayo de reacción fluorocromática (FCR) (que muestra la viabilidad del polen) y ensayo de germinación in vitro Figura 2. Fotografías de microscopía electrónica de barrido de los pólenes