Método para producir astaxantina o un producto metabólico de la misma utilizando genes de carotenoide cetolasa y carotenoide hidroxilasa.

Un microorganismo o una planta transformados con

(i) un gen de anillo de ß-ionona 4-cetolasa que codifica

(a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:

2; o

(b) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada enel SEQ ID NO: 2 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad deanillo de ß-ionona 4-cetolasa; y

(ii) un gen de anillo de ß-ionona 3-hidroxilasa que codifica

(c) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10; o

(d) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada enel SEQ ID NO: 10 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y tiene actividad de anillode ß-ionona 3-hidroxilasa;

siendo el microorganismo o la planta capaces de sintetizar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster deastaxantina.

Método para producir astaxantina o un producto metabólico de la misma utilizando genes de carotenoide cetolasa y carotenoide hidroxilasa

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o ésteres de astaxantina utilizando un microorganismo o una planta transformados con un gen de oxigenasa que codifica una enzima que sustituye un grupo metileno en la posición 4 (4') de un anillo de β-ionona (anillo β) de un carotenoide con un grupo ceto y un gen de hidroxilasa que codifica una enzima que introduce un grupo hidroxilo en el carbono de la posición 3 (3') de un anillo de β-ionona (anillo β) de un carotenoide.

Técnica anterior

Carotenoide (también denominado "carotinoide") es un término general para los pigmentos que se encuentran de manera abundante en la naturaleza y está formado por una cadena principal de isopreno de 40 átomos de carbono. Hasta la fecha, se han aislado más de 600 especies de carotenoides (Pfander, H., ed., Key to Carotenoids, Birkhauser, Basel, 1987) . Recientemente, se han reconocido los efectos profilácticos de los carotenoides en diferentes enfermedades crónicas tales como el cáncer, y se han realizado numerosos informes (véanse, por ejemplo, Nishino, H., Murakoshi, M., Yano, M. Food Style 21, 4, 53-55, 2000; Nishino, H. et al, Carotenoids in cancer chemoprevention, Cancer Metastasis Rev. 21, 257-264, 2002; Mayne, S.T., β-Carotene, carotenoids, and disease prevention in humans, FASEB J., 10, 690-701, 1996) . Entre ellos, la astaxantina es un carotenoide que ha sido particularmente reconocido como material para la alimentación sana, recientemente (Uonomi, T., Antioxidant effect and cancer-metastasis-suppressive effect of, the greatest carotenoid of all time, "astaxantin", Food Style 21, 4, 70-75, 2000) . La evaluación in vitro de la astaxantina en cuanto al efecto de eliminación del oxígeno singlete, que es un tipo de oxígeno activo, demuestra que el efecto de la astaxantina es 500 veces mayor que el de la vitamina E, 40 veces mayor que la del β-caroteno, y 10 veces mayor que la del licopeno. Adicionalmente, en estudios epidemiológicos y clínicos de sujetos humanos, se ha observado que la astaxantina suprime la oxidación de la LDL de la sangre y de ese modo suprime la arteriosclerosis (documento anteriormente mencionado: Uonomi, T. Food Style 21, 4, 70-75, 2000) . Además, se ha revelado que la astaxantina intensifica la actividad de las células NK y tiene efectos sobre la prevención de las cataratas, la degeneración macular asociada con la edad, y el cáncer de vejiga (documento anteriormente mencionado: Food Style 21, 4, 70-75, 2000; Tanaka, T. et al, Chemoprevention of mouse urinar y bladder carcinogenesis by the naturally occurring carotenoid astaxanthin, Carcinogenesis 15, 15-19, 1994) .

La astaxantina se prepara comercialmente extrayéndola de crustáceos tales como eufaúsidos y langostas, y también se extrae de un cultivo de algas verdes productoras de astaxantina Haematococcus pluvialis. Sin embargo, en el primer caso, la astaxantina tiene desventajas en la calidad y el coste, esto es, disparidad en la concentración del pigmento, un olor peculiar para materias primas, y un bajo rendimiento. En el último caso, la astaxantina no puede ser producida de manera estable debido al requerimiento de cultivo durante un largo período de tiempo a una temperatura intermedia a un pH neutro. De este modo, hasta la fecha, no se ha logrado alcanzar un suministro estable de astaxantina poco costosa. Por lo tanto, el suministro estable de astaxantina poco costosa puede permitir llevar a cabo diferentes ensayos fisiológicos novedosos para evaluar los efectos ventajosos de la astaxantina sobre la salud humana. Por consiguiente, el actual mercado de comida sana se ampliará significativamente.

Con el fin de lograr el objeto anteriormente mencionado, se puede suministrar astaxantina comercialmente diseñando un microorganismo o una planta recombinante que pueda producir una gran cantidad de astaxantina por medio del diseño metabólico. Los genes que permiten que un microorganismo o una planta produzcan astaxantina ya han sido obtenidos. Ha sido posible elaborar un microorganismo tal como una bacteria o una levadura o un órgano específico de una planta, que no producía originalmente carotenoides, que sintetiza astaxantina utilizando estos genes (Documento no de Patente 1: Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser. P.D., y Misawa, N., Production of the carotenoids, lycopene, β-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998; Mann, V., Harker, M., Pecker, I., y Hirschberg, J., Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers, Nat. Biotechnol. 18, 888-892, 2000) . No obstante, cuando todos los genes necesarios para sintetizar astaxantina ya se han introducido y expresado, se acumula una gran cantidad de intermedios biosintéticos de astaxantina además de la astaxantina como producto final. Estos intermedios son carotenoides que son intermedios biosintéticos producidos en las rutas de β-caroteno a astaxantina (véase la FIG. 1) . Estas rutas son etapas que determinan la velocidad de la síntesis de astaxantina. En un ejemplo en el que se utiliza una Escherichia coli recombinante, además de astaxantina (36 a 50%) como producto final, se detectaron intermedios biosintéticos tales como adonixantina (4-cetozeaxantina) , adonirrubina (fenicoxantina) , cantaxantina, 3hidroxiequinenona, 3'-hidroxiequinenona (Documento no de Patente 1) . Recientemente, se ha introducido un gen de anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) (crtO) derivado de Haematococcus pluvialis en Arabidopsis yse ha expresado en las semillas. Sin embargo, todos los carotenoides produjeron principalmente intermedios biosintéticos (adonirrubina, cantaxantina, y similares) de astaxantina. Se ha revelado que dos enzimas, esto es, anillo de β-ionona 3-hidroxilasa (β-C3-hidroxilasa) (CrtZ) y anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) (CrtW, CrtO, o Bkt) , son responsables de la ruta de síntesis desde β-caroteno a astaxantina (véase la FIG. 1) . Por lo tanto, se ha deseado incrementar la eficacia de estas dos enzimas para acelerar la producción de astaxantina. Por ejemplo, la eficacia de la anillo de β-ionona 4-cetolasa para convertir adonixantina en astaxantina es particularmente baja, y por lo tanto la adonixantina se acumula en muchos casos (Documento no de Patente 2: Yokoyama, A. y Miki, W., Composition and presumed biosynthetic pathway of carotenoids in the astaxanthin-producing bacterium Agrobacterium aurantiacum, FEMS Microbiol. Lett. 128, 139-144, 1995) .

Documento no de Patente 1: Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., y Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level, J. Bacteriol. 177, 6575-6584, 1995. Documento no de Patente 2: Fraser, P.D., Shimada, H., y Misawa, N., Enzymic confirmation of reactions involved in routes to astaxanthin formation, elucidated using a direct substrate in vitro assay, Eur. J. Biochem. 252, 229-236, 1998.

Descripción de la invención Problemas que va a resolver la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir eficazmente astaxantina o metabolitos de la misma utilizando un microorganismo o planta recombinantes, que están transformados con genes que codifican una enzima que sustituye un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de β-ionona por un grupo ceto [anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) ; carotenoide 4, 4'-β-oxigenasa] y una enzima que introduce un grupo hidroxilo en la posición del carbono 3 de un anillo de β-ionona [anillo de β-ionona 3-hidroxilasa (β-C3-hidroxilasa) ; carotenoide 3, 3'-β-hidroxilasa] y expresan tales genes.

Métodos para resolver el problema Los autores de la presente invención se han centrado en el hecho de que aunque una bacteria marina Brevundimonas sp. cepa SD-212 (MBIC 03018) es capaz de producir astaxantina y metabolitos de la misma, las propiedades de sus enzimas de biosíntesis de carotenoides todavía no se han revelado. Los autores de la presente invención han llevado a cabo estudios exhaustivos y, como resultado, han descubierto que una oxigenasa clonada a partir de la bacteria marina y que es capaz de remplazar un grupo metileno en la posición 4 de un anillo de β-ionona por un grupo ceto [CrtW: anillo de β-ionona 4-cetolasa (β-C4-cetolasa) ; carotenoide 4, 4'-β-oxigenasa] puede sintetizar eficazmente astaxantina a partir de adonixantina. Además, los autores... [Seguir leyendo]

1. Un microorganismo o una planta transformados con

(i) un gen de anillo de β-ionona 4-cetolasa que codifica 5 (a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2; o

(b) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 2 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y que tiene actividad de anillo de β-ionona 4-cetolasa; y

(ii) un gen de anillo de β-ionona 3-hidroxilasa que codifica 10 (c) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10; o

(d) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 10 mediante adición, deleción, o sustitución de cinco o menos aminoácidos y tiene actividad de anillo de β-ionona 3-hidroxilasa; siendo el microorganismo o la planta capaces de sintetizar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina.

2. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es Escherichia coli.

3. Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, comprendiendo el método

las etapas de cultivar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en un medio y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina a partir del cultivo o las células.

4. Un método para preparar astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un éster de astaxantina, comprendiendo el método las etapas de cultivar la planta de acuerdo con la reivindicación 1 y obtener astaxantina, 2-hidroxiastaxantina o un 25 éster de astaxantina a partir de la planta.