Método para preparar un producto a base de masa.

Método de preparación de una masa o un producto comestible a base de masa,

que comprende la adición de unpolipéptido con actividad de alfa-amilasa maltogénica a la masa, donde la masa comprende al menos 10 % de sacarosa

en peso, y el polipéptido:

a) tiene una secuencia de aminoácidos que es como mínimo 70 % idéntica a la SEQ ID nº: 1, y

b) comparado con SEQ ID nº: 1 comprende una alteración de aminoácidos que es sustitución o deleción de oinserción adyacente a I15; R18; K44; N86; T87; G88; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192;

F194; L196; D329; N371; D372; P373; N375 o R376, y,

c) tiene más del 20 % de actividad en 10 % de sacarosa, en comparación con su actividad en ausencia desacarosa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2005/000602.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: KROGSHOEJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.

Inventor/es: BEIER,LARS, FRIIS,ESBEN PETER, LUNDKVIST,HENRIK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A21D8/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A21 COCCION EN HORNO; EQUIPAMIENTO PARA LA PREPARACION O EL TRATAMIENTO DE LA MASA; MASAS PARA COCER EN HORNO.A21D TRATAMIENTO, p.ej. CONSERVACION DE LA HARINA O DE LA MASA, p.ej. POR ADICION DE INGREDIENTES; COCCION; PRODUCTOS DE PANADERIA; SU CONSERVACION. › A21D 8/00 Métodos de preparación o de cocción de la masa (tratamiento de la harina o de la masa por adición de ingredientes A21D 2/00). › tratando la masa con microorganismos o enzimas.
  • C12N9/28 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana.

PDF original: ES-2399341_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para preparar un producto a base de masa LISTADO DE SECUENCIAS Y MICROORGANISMOS DEPOSITADOS

Listado de secuencias [0001] La presente invención comprende un listado de secuencias.

Depósito de material biológico [0002] Ninguno.

Campo de la invención [0003] La presente invención se refiere al uso de amilasas de antiendurecimiento en la preparación de masa o productos comestibles a base de masa con un alto contenido en sacarosa.

Antecedentes de la invención [0004] La US 3026205 describe un proceso de producción de dulces horneados y los productos resultantes de los mismos por alfa-amilasa.

La WO 9104669 describe el uso de una alfa-amilasa maltogénica para retardar el endurecimiento de los productos horneados tales como pan; la alfa-amilasa maltogénica descrita en ésta está comercialmente disponible bajo el nombre comercial de Novamyl® (producto de Novozymes A/S) . La US 6162628 describe variantes de Novamyl y su uso para el mismo fin. Conforti et al: (J. Food Quality, Food and Nutrition, 1998, 21: 85-94) y Sternhagen et al: (Cereal Chemistr y , 1994, 71; 560-563) divulgan el uso de alfa-amilasas bacterianas en masa con alto contenido en azúcar. Rosell et al: (J Agric Food Chem, 2001, 49; 2973-2977) divulga que Novamyl 1500 MG es seriamente inhibido por la sacarosa.

Las estructuras tridimensionales de Novamyl se publican en la US 6162628 y en el Protein Data Bank (banco de datos de proteínas, disponible en http://www.rcsb.org/pdb/) con identificadores 1QHO y 1QHP.

Resumen de la invención [0007] Los inventores han encontrado que una masa con alto contenido en sacarosa (tal como una masa de pastel) tiende a inhibir la actividad de unas amilasas de antiendurecimiento tales como Novamyl, haciéndolas menos eficaces para prevenir el endurecimiento de productos a base de masa con alto contenido en sacarosa, tales como pasteles. Han encontrado que un buen efecto de antiendurecimiento en pasteles se puede conseguir usando una amilasa antiendurecimiento cuidadosamente seleccionada con propiedades determinadas y han identificado tales amilasas.

Analizando una estructura 3D de Novamyl, los inventores además encontraron que la sacarosa puede inhibir por unión en el sitio activo. Han encontrado que la sacarosa se acopla en el sitio activo de Novamyl diferentemente del sustrato o inhibidor en modelos publicados 1QHO y 1 QHP, y han usado este hallazgo para diseñar variantes tolerantes a la sacarosa.

Por consiguiente, la invención proporciona un método de preparación de masa o de un producto comestible a base de masa (p. ej. un producto horneado) añadiendo una amilasa antiendurecimiento tolerante a la sacarosa.

Descripción detallada de la invención Alfa-amilasa maltogénica y acoplamiento de sacarosa [0010] Una alfa-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) con más del 70 % de identidad (particularmente más del 80 % o 90%, tal como al menos 95% o 96% o 97% o 98% o 99%) con la secuencia de Novamyl mostrada como SEQ ID nº: 1 se puede utilizar como enzima parental para diseñar variantes tolerantes a la sacarosa. La identidad de aminoácido se puede calcular como se describe en la US 6162628.

Para Novamyl (SEQ ID nº: 1) , se puede utilizar una estructura 3D que incluya un sustrato o inhibidor como se describe en la US 6162628 o en el Protein Data Bank con el identificador 1QHO o 1 QHP. Alternativamente, se puede utilizar una variante de Novamyl, tal como una variante descrita en la US 6162628 o en esta especificación, por ejemplo la variante F188L +D261 G +T288P. Un estructura 3D de una variante se puede desarrollar a partir de la estructura de Novamyl por métodos conocidos, por ejemplo como se describe en T.L. Blundell et al., Nature, vol. 326, p. 347 ff (26 March 1987) ; J. Greer, Proteins: Structure, Function and Genetics, 7:317-334 (1990) ; o el ejemplo 1 de WO 9623874.

Los inventores encontraron que la sacarosa puede inhibir Novamyl por unión en el sitio activo. El acoplamiento de sacarosa en el sitio activo de Novamyl (usando el software versión GOLD 2.1.2, Cambridge Cr y stallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge, CB2 1EZ, Reino Unido y la parte de proteína de la estructura de rayos X

1QHO.pdb) revela una configuración de enlace específico como único para sacarosa. Las coordenadas cartesianas para los átomos de sacarosa en esta configuración de unión, utilizando el sistema de coordenadas de la estructura de rayos X 1QHO.pdb se dan en la Fig. 1.

Ensayo de alfa-amilasa maltogénica [0013] La actividad de una alfa-amilasa maltogénica se puede determinar usando un ensayo de actividad tal como el método MANU. Un MANU (Maltogenic Amylase Novo Unit, Novo Unidad de Amilasa Maltogénica) se define como la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol de maltosa por minuto en una concentración de 10 mg de sustrato de maltotriosa por ml en 0, 1 M de tampón de citrato en pH 5, 0, 37°C durante 30 minutos.

Alteraciones de aminoácidos [0014] La secuencia de aminoácidos de una alfa-amilasa maltogénica se puede alterar para reducir la inhibición de sacarosa. Los inventores encontraron que la alteración se pueden hacer en un residuo de aminoácidos con al menos un átomo dentro de 4 Angstroms de cualquiera de los átomos de sacarosa cuando la molécula de sacarosa se acopla en la estructura 3D de la alfa-amilasa maltogénica. Usando la estructura de Novamyl 1QHO y el acoplamiento de sacarosa en la figura 1, los siguientes residuos de Novamyl están dentro de 4 A: K44; N86; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192; F194; D372; P373; R376.

Además, las siguientes posiciones se han identificado como importantes: I15; R81; T87; G88; L196; N371 o N375 de SEQ ID nº: 1.

La alteración puede ser una sustitución o deleción de uno o varios de los residuos seleccionados, o uno o más residuos (particularmente 1-4 residuos o 5-6 residuos) se pueden insertar adyacentes a un residuo seleccionado.

La sustitución puede ser con un residuo mayor o menor. Una sustitución para aumentar el tamaño del residuo puede disminuir el espacio obtenido por la molécula de sacarosa acoplada previniendo así la unión de sacarosa. Los residuos de aminoácidos se clasifican de la siguiente manera de menor a mayor: (un signo igual indica residuos con tamaños que son prácticamente indistinguibles) :

La sustitución puede también ser tal como eliminar contactos con la molécula de sacarosa, en particular por movimiento o deleción de sitios potenciales de unión de hidrógeno o interacciones de Van der Waals.

La sustitución puede ser particularmente con otro residuo del mismo tipo donde el tipo es negativo, positivo, hidrofóbico o hidrofílico. Los residuos negativos son D, E, los residuos positivos son K/R, los residuos hidrofóbicos son A, C, F, G, I, L, M, P, V, W, Y, y los residuos hidrofílicos son H, N, Q, S, T.

Algunos ejemplos particulares de sustituciones son I15T/S/V/L, R18K, K44R/S/T/Q/N, N86Q/S/T, T87N/Q/S, 45 G88A/S/T, Y89W/F/H, H90W/F/Y/R/K/N/Q/M, W93Y/F/M/E/G/V/T/S, F188H/L/I/T/G/V, D190E/Q/G, A192S/T, F194S/L/Y, L196F, N371 K/R/F/Y/Q, D372E/Q/S/T/A y N375S/T/D/E/Q.

Ejemplos de deleciones son la deleción del residuo 191 o 192. Un ejemplo de una inserción es Ala insertada entre 192 y 193.

El polipéptido puede incluir otras alteraciones en comparación con Novamyl (SEQ ID nº: 1) , por ejemplo alteraciones para aumentar la termoestabilidad, como se describe en la US 6162628.

Nomenclatura para alteraciones de aminoácidos 55 [0023] En esta especificación, se describe una sustitución de aminoácidos usando códigos de una sola letra, por ejemplo K44R. Las barras se utilizan para indicar alternativas, por ejemplo K44R/S/T/Q/N para indicar la sustitución de K44 con R o S, etc. P191* indica una deleción de P191. *192aA indica la inserción de una Ala después de A192. Las comas se utilizan para indicar alteraciones múltiples en la secuencia, por ejemplo F188L, D261G, T288P para indicar

una variante con tres sustituciones.

Propiedades de amilasa antiendurecimiento para su uso con sacarosa [0024] La amilasa para el uso en la masa con alto contenido en sacarosa se puede seleccionar para que tenga 65 principalmente actividad de exo-amilasa. Más específicamente, la amilasa hidroliza la amilosa de modo que el peso molecular medio de la amilosa después de 0, 4-4 % de hidrólisis es más del 50 % (particularmente más del 75 %) del peso molecular antes de la hidrólisis.

Así, la amilasa puede hidrolizar amilosa (p. ej. amilosa de trigo o amilosa sintética) de modo que el peso molecular medio de la amilosa después de 0, 4-4 % de hidrólisis (es decir, entre 0, 4-4 % de hidrólisis del número total de enlaces) es más del 50 % (particularmente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de preparación de una masa o un producto comestible a base de masa, que comprende la adición de un polipéptido con actividad de alfa-amilasa maltogénica a la masa, donde la masa comprende al menos 10 % de sacarosa 5 en peso, y el polipéptido:

a) tiene una secuencia de aminoácidos que es como mínimo 70 % idéntica a la SEQ ID nº: 1, y b) comparado con SEQ ID nº: 1 comprende una alteración de aminoácidos que es sustitución o deleción de o inserción adyacente a I15; R18; K44; N86; T87; G88; Y89; H90; Y92; W93; F188; T189; D190; P191; A192;

F194; L196; D329; N371; D372; P373; N375 o R376, y, c) tiene más del 20 % de actividad en 10 % de sacarosa, en comparación con su actividad en ausencia de sacarosa.

2. Método según la reivindicación 1 donde la alteración es sustitución con un residuo de aminoácido mayor o menor. 15

3. Método según la reivindicación 1 donde la alteración es inserción de 1-4 residuos de aminoácidos en el lado N- o Cdel residuo específico.

4. Método según la reivindicación 1 donde el polipéptido comprende una sustitución I15T/S/V/L, R18K, K44R/S/T/Q/N,

N86Q/S/T, T87N/Q/S, G88A/S/T, Y89W/F/H, H90W/F/Y/R/K/N/Q/M, W93Y/F/M/E/G/V/T/S, F188H/L/I/T/G/V, D190E/Q/G, A192G/S/T/Q/R, F194S/L/Y, L196F, N371 K/R/F/Y/Q o D372E/Q/S/T/A, N375S, una deleción de 191 o 192

o una inserción de Ala después de 192.

5. Método según la reivindicación 1 donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº: 1 con uno de 25 los siguientes conjuntos de alteraciones:

Alteraciones comparadas con SEQ ID nº: 1

D261D, T288P

F188L, D261G, T288P

T288P

Y89F, D261 G, T288P

N86V, F188L, D261G, T288P

Y89F, F188L, D261 G, T288P

Y89H, F188L, D261G, T288P

N86T, F188L, D261G, T288P

F194S, D261G, T288P

L196F

D261G, T288P, D372V

Q184H, N187D, F194Y

D190G

N86G, Y89M, F188L, D261G, T288P

F188L, D190G, D261 G, T288P

A192Q, D261G, T288P, S446A

F188H

P191*

A192*

A192*, G193*

*192aA

N86K, F252L, D261 G, T288P

F194Y, L225S, D261G, T288P

F194L, D261G, T288P

F194S, D261 G, T288P, P642Q

D261G, T288P, N375S

F188T

F188G

F188V

A192R, F194L, D261 G, T288P, G469R

A192G, D261G, T288P

Y89F, D261G, T288P, I290V, N375S

 

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