Método para preparar armazón poroso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células.
Un método para preparar un armazón poroso que comprende las etapas que consisten en:
a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidadde un agente de reticulación covalente y una cantidad de un agente porógeno,
b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de 4°C a 80°C durante untiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido,
c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa,
d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c).
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/063671.
Solicitante: INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE).
Inventor/es: LETOURNEUR, DIDIER, LE VISAGE,CATHERINE.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61L27/20 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › A61L 27/00 Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/80; riñones artificiales A61M 1/14). › Polisacáridos.
- A61L27/38 A61L 27/00 […] › Células animales (para utilizar en piel artificial A61L 27/60).
- A61L27/50 A61L 27/00 […] › Materiales caracterizados por su función o por sus propiedades físicas.
- A61L27/52 A61L 27/00 […] › Hidrogeles o hidrocoloides.
- A61L27/56 A61L 27/00 […] › Materiales porosos o celulares.
- C12N5/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
PDF original: ES-2408554_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Método para preparar armazón poroso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células.
Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para preparar un armazón poroso para ingeniería de tejidos. Es otro objeto de la presente invención proporcionar un armazón poroso obtenible por el método como se describió anteriormente y su uso para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro de células.
Antecedentes de la invención La ingeniería de tejidos se define en general como la creación de equivalentes de tejidos u órganos por siembra de células sobre o en un armazón adecuado para implante. Los armazones deben ser compatibles y las células deben ser capaces de unirse y proliferar en los armazones para que formen equivalentes de tejidos u órganos. Estos armazones se pueden considerar, por lo tanto, como sustratos para crecimiento celular in vitro o in vivo.
Los atributos de un armazón biocompatible ideal incluirían la capacidad para soportar crecimiento celular in vitro o in vivo, la capacidad para soportar el crecimiento de una amplia variedad de tipos de células o linajes, la capacidad para estar dotado de grados variables de flexibilidad o rigidez requerida, la capacidad para presentar grados variables de biodegradabilidad, la capacidad para ser introducido en el sitio deseado in vivo sin provocar un daño secundario y la capacidad para servir como vehículo o depósito para suministro de fármacos o sustancias bioactivas al sitio de acción deseado.
Se ha utilizado una serie de diferentes materiales de armazón, para regeneración de tejido guiada y/o como superficies biocompatibles. Los materiales poliméricos biodegradables se prefieren en muchos casos puesto que el armazón se degrada con el tiempo y finalmente la estructura del armazón celular es reemplazada completamente por las células. Entre los muchos candidatos que pueden servir como armazones útiles reivindicados para soportar crecimiento o regeneración de tejidos, se incluyen geles, espumas, láminas y numerosas estructuras en forma de partículas porosas de diferentes formas y conformaciones.
Entre los polímeros naturales colectores que se ha descrito que son útiles para ingeniería o cultivo de tejidos, se pueden enumerar diversos constituyentes de la matriz extracelular incluyendo fibronectina, diversos tipos de colágeno y laminina, así como queratina, fibrina y fibrinógeno, ácido hialurónico, sulfato de heparina, sulfato de condroitina y otros.
Otros polímeros comunes que se usaron incluyen poli (lactida-co-glicolida) (PLG) . PLG son polímeros hidrolíticamente degradables que son homologados por la FDA para uso en el cuerpo y mecánicamente fuertes (Thomson RC, Yaszemski MJ, Powers JM, Mikos AG. Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone. Ed. J Biomater Sci Polym 1.995; 7 (1) : 23-38; Wong WH. Mooney DJ. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering. En: autores Atala A, Mooney DJ; autores asociados Langer R, Vacanti JP. Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston: Birkhäuser: 1.997. pág. 51-82) . Sin embargo, son hidrófobos y se tratan típicamente en condiciones relativamente estrictas, que hace potencialmente un reto la incorporación de factor y la inclusión de células viables.
Como una alternativa, una variedad de hidrogeles, se ha usado una clase de materiales poliméricos altamente hidratados (contenido en agua mayor que 30% en peso) como materiales de armazón. Están constituidos por cadenas poliméricas hidrófilas, que son de origen sintético o natural. La integridad estructural de los hidrogeles depende de las reticulaciones formadas entre cadenas poliméricas por diversos enlaces químicos e interacciones físicas.
Por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.586.246 B1 ha desvelado un método para preparar un armazón de hidrogel poroso que se puede usar como soportes para ingeniería de tejidos o matrices de cultivo. El método del documento comprende las etapas que consisten en: a) disolver un polímero sintético biodegradable en un disolvente orgánico para preparar una disolución polimérica de alta viscosidad b) añadir un agente porógeno a esta disolución; c) moldear el polímero en un molde d) retirar el disolvente orgánico e) sumergir el polímero sin disolvente orgánico / suspensión de gel de sal en una disolución acuosa caliente o disolución ácida para causar que la sal experimente efervescencia a temperatura ambiente para formar el armazón poroso. Sin embargo, este método de preparación de un hidrogel poroso implica el uso de un disolvente orgánico con un polímero sintético que hace el método según esta invención poco compatible con fines biológicos y terapéuticos.
La patente de EE.UU. 5840777 desvela un método para producir una espuma de polisacárido tal como quitosán, reticulándolo con glutaraldehído, añadiendo un agente de formación de espuma tal como carbonato de calcio y usándolo como un apósito de herida o como un implante que contiene células.
La patente europea EP 1166987 desvela métodos para producir espumas biocompatibles con una superficie microestructurada dispuesta sobre al menos una superficie de la espuma, que proporciona una plantilla que facilita la organización celular y la regeneración de tejido. El método comprende la etapa de poner en contacto una disolución de polímeros con una superficie de un molde.
La patente de EE.UU. 2006/0153814 desvela un método para producir una matriz porosa, que comprende proporcionar una pluralidad de partículas que contienen un catión multivalente, mezclar las partículas con polisacáridos reticulados iónicos y agua para formar una mezcla, introducir un reticulador para solidificar la mezcla, disolver las partículas de la mezcla en un ácido para formar una estructura porosa y neutralizar y reticular la estructura porosa para obtener la matriz porosa.
Por lo tanto, aún hay una necesidad existente en la técnica de desarrollar un método para preparar matrices de armazón poroso que se puedan usar para fines biológicos y terapéuticos.
Sumario de la invención Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar un armazón poroso que
comprende las etapas que consisten en: a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidad de un agente de reticulación y una cantidad de un agente porógeno.
b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 80°C durante un tiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido y c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa
d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c) . Es otro objeto de la presente invención proporcionar un armazón poroso obtenible por el método como se describió en la reivindicación 4.
Es otro objeto más de la presente invención proporcionar el uso de armazón poroso de la invención para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro celular.
Descripción detallada de la invención
Definiciones:
El término quot;polisacáridoquot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende dos o más unidades monosacárido. El término quot;disolución alcalinaquot;, como se usa en la presente memoria, indica una disolución con un pH superior a 7. El término quot;disolución ácidaquot;, como se usa en la presente memoria, indica una disolución con un pH inferior a 7. El término quot;disolución acuosaquot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a una disolución en que el disolvente
es agua. El término quot;reticulaciónquot; se refiere a la unión de una cadena polimérica a otra con enlaces covalentes. El término quot;agente porógenoquot; indica cualquier agente sólido que tiene la capacidad de formar poros dentro de una
estructura sólida. Como se usa en la presente memoria, un quot;armazónquot; se define como un sistema semisólido que comprende una red tridimensional de una o más especies de cadenas de polisacárido. Dependiendo de las propiedades del polisacárido
(o polisacáridos) usado, así como de la naturaleza y densidad de la red, dichas estructuras en equilibrio pueden contener diversas cantidades de agua. El término quot;agente de reticulaciónquot; incluye cualquier agente capaz de introducir reticulación entre las cadenas de los
polisacáridos de la invención.
quot;Biodegradablequot;, como se usa en la presente memoria, se refiere a materiales que se degradan in vivo a compuestos no tóxicos,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un método para preparar un armazón poroso que comprende las etapas que consisten en:
a) preparar una disolución acuosa alcalina que comprende una cantidad de al menos un polisacárido, una cantidad de un agente de reticulación covalente y una cantidad de un agente porógeno, b) transformar la disolución en un hidrogel poniendo dicha disolución a una temperatura de 4°C a 80°C durante un tiempo suficiente para permitir la reticulación de dicha cantidad de polisacárido, c) sumergir dicho hidrogel en una disolución acuosa, d) lavar el armazón poroso obtenido en la etapa c) .
2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es seleccionado del grupo que consiste en: dextrano, agar, ácido algínico, ácido hialurónico, pululano, inulina, heparina, fucoidán, quitosán y mezclas de los mismos.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho agente de reticulación covalente es seleccionado del grupo que consiste en: trimetafosfato trisódico (STMP) , oxicloruro de fósforo (POCl3) , epiclorohidrina, formaldehídos, carbodiimidas hidrosolubles y glutaraldehídos.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente de reticulación covalente es trimetafosfato trisódico (STMP) .
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente porógeno es seleccionado del grupo que consiste en: carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, carbonato de calcio, carbonato de sodio y bicarbonato de sodio y mezclas de los mismos y el líquido de la etapa b) es una disolución ácida.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la relación en peso del polisacárido al agente porógeno está en el intervalo de 6:1 a 1:1.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la relación en peso del polisacárido al agente de reticulación está en el intervalo de 15:1 a 1:1.
8. Un armazón poroso obtenible por el método según la reivindicación 4.
9. El armazón poroso según la reivindicación 8, en el que el tamaño de los poros está comprendido entre 1 μm y 500 μm.
10. El armazón poroso según la reivindicación 8 ó 9, en el que la porosidad está en el intervalo de 4% a 50%.
11. El armazón poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, cargado con una cantidad de células, seleccionadas preferiblemente del grupo que consiste en: células de levaduras, células de mamífero, células de insecto y células de plantas.
12. El armazón poroso según la reivindicación 11, en el que las células son células de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en: condrocitos; fibrocondrocitos; osteocitos; osteoblastos; osteoclastos; sinoviocitos; células de médula ósea; células epiteliales, hepatocitos, células mesenquimales; células estromales; células musculares; células madre; células madre embriónicas; células precursoras procedentes de tejido adiposo; células progenitoras de sangre periférica; células madre aisladas de tejido adulto y células transformadas de manera genética.
13. El armazón poroso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para ingeniería de tejidos, cultivo celular y suministro celular.
14. Un sustituto vascular fabricado con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a
11.
15. Cartílago o implantes óseos fabricados con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
16. Uso de un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para la evaluación de la toxicidad y/o farmacología de un producto.
17. Un sistema de liberación controlada de un agente activo fabricado con un armazón como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
Figura 1
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