MÉTODO PARA EL INCREMENTO DE LA PRODUCCIÓN DE LACASA EN CORIOLOPSIS MEDIANTE UN INDUCTOR BIOLÓGICO.

Método para el incremento de la producción de lacasa en Coriolopsis mediante un inductor biológico.

La invención se refiere a un método de producción incrementada de la enzima lacasa en un organismo del género Coriolopsis, el cual comprende co-cultivar dicho organismo con uno del género Penicillium. Este método adicionalmente puede incluir la purificación de la lacasa.

Método para el incremento de la producción de lacasa en Coriolopsis mediante un inductor biológico.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología, y específicamente, se refiere a un método para la producción incrementada de lacasa en un organismo del género Coriolopsis, que comprende co-cultivar dicho organismo junto con otro organismo del género Penicillium.

Estado de la técnica anterior

Las lacasas son enzimas de tipo fenoloxidasas que catalizan la oxidación de compuestos aromáticos y ligninas. Debido a esta capacidad de oxidación, estas enzimas son ampliamente utilizadas en diferentes industrias como la cosmética, alimentaria, textil, e incluso en campos como la bioelectroquímica o la nanotecnología.

Por otro lado, debido a si capacidad de degradar compuestos aromáticos, esta enzima también es utilizada en la degradación de pesticidas y compuestos xenobióticos como hidrocarburos policíclicos aromáticos, o en la biorremediación de residuos agroindustriales.

Estas lacasas, presentan una baja especificidad de sustrato, y su eficacia catalítica varía mucho en función de la presencia o ausencia de inductores de la misma, así como de la naturaleza de los mismos. Para el uso de estas enzimas, a nivel industrial, es necesaria una alta actividad enzimática. Para aumentar esta actividad enzimática se han utilizado de forma generalizada microelementos como por ejemplo el cobre u otros inductores químicos como por ejemplo el alcohol veratrílico, vainillina, alcalignina o ácido vanílico. Estos inductores presentan como ventaja el incremento significativo de los niveles de lacasa, pero su uso industrial supone diversos problemas como el alto coste de dichos compuestos por las elevadas cantidades necesarias, o la posible toxicidad de los mismos en los productos finales.

Por ello se hace necesaria la búsqueda de elementos alternativos a esos inductores químicos y microelementos.

Para tratar de aumentar la producción se han tratado de utilizar cultivos de organismos como por ejemplo el hongo Trametes sp (Xiao et al. 2003, Appl. Microbiol. Biot., 60: 700-707) o Coriolopsis rigida. Estos organismos se ha demostrado que presentan altas producciones de lacasa. A pesar de ello, para obtener niveles adecuados de producción, es necesario además, añadir a los cultivos de estos microorganismos inductores químicos como por ejemplo metales pesados como el cobre, la lignina kraft o mezclas de fenoles. Este método presenta los mismos inconvenientes como son los elevados costes y la posible contaminación por parte de estos productos.

Para salvar esta deficiencias se han utilizado otras aproximaciones como por ejemplo el uso de salvado de cebada como sustrato para los microorganismos además de cobre para de esta forma reducir las cantidades necesarias, y aumentar la producción (Gómez et al. 2006, Biotechnol Lett. 28: 1013-1017) .

Aún mediante esta aproximación las producciones son inferiores a las deseadas por lo que siguen siendo necesarias otras aproximaciones para la elevada producción de lacasas. Esto ha llevado al estudio de inducciones biológicas de la producción de lacasas en diversos organismos. De esta forma, se han estudiado por ejemplo la inducción de la producción de lacasa mediante el co-cultivo con Trichoderma tanto en Pleurotus ostreatus (Velázquez-Cedaño et al., 2004, Mycologia. 96: 712-719) como en Trametes sp (Zhang et al., 2006, Appl Microbiol Biot. 73: 89-94) . A pesar de ello, aun sigue siendo necesario la mejora de la producción de lacasa ya que los niveles de producción alcanzados no son los deseados para la producción industrial.

Por tanto, resulta necesario encontrar nuevos sistemas que permitan obtener mayores cantidades de la enzima lacasa, que no necesiten de inductores químicos, ya que pueden producir contaminaciones en los productos, y que elevan el coste de producción.

Descripción de la invención La presente invención refiere a un método para la producción incrementada de lacasa en un organismo del género Coriolopsis mediante el co-cultivo con un organismo del género Penicillium.

En la presente invención se demuestra como el co-cultivo de Coriolopsis junto a un hongo del género Penicillium, provoca un aumento de la producción de Coriolopsis frente al cultivo en un medio completo. Este método también presenta ventajas frente a la inducción habitual en la producción de estas enzimas como, por ejemplo, la no necesidad de utilizar compuestos químicos, y que la inducción es mayor mediante este método que mediante el uso de inductores ampliamente utilizados, como muestras fenólicas o cobre. En la presente invención se observa que este incremento es de unas 3000 veces sobre el cultivo basal de Coriolopsis, unas 150 veces sobre la inducción con una mezcla fenólica, y de más del doble frente a la adición de cobre.

Por todo ello un primer aspecto de la invención se refiere a un método (de ahora en adelante método de la invención) para la producción incrementada de lacasa en un organismo del género Coriolopsis, que comprende co-cultivar dicho organismo junto con otro organismo del género Penicillium.

En la presente invención se entiende por “co-cultivo” o “co-cultivar” aquel proceso mediante el cual se hacen crecer juntas en un mismo medio de cultivo, dos o más tipos celulares. En la presente invención el co-cultivo se realiza mediante la mezcla de células procedentes de dos hongos diferentes, uno del género Coriolopsis, y otro del género Penicillium.

Los organismos del género Coriolopsis, pertenecen al Superreino Eukar y ota, (grupo Metazoa/Fungi) , Reino Fungi, Subrreino Dikar y a, Phylum Basidiomycota, Clase Agaricomycetes, Orden Polyporales, Familia Coriolaceae.

Los organismos del género Penicillium pertenecen al Superreino Eukar y ota, (grupo Metazoa/Fungi) , Reino Fungi, Subrreino Dikar y a, Phylum Ascomycota, Subphylum Pezizomycotina; Clase Eurotiomycetes, Orden Eurotiales, Familia Trichocomaceae.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método de la invención comprende los pasos:

a) cultivar un organismo del género Coriolopsis b) añadir al cultivo del paso a) un organismo del género Penicillium, y

c) co-cultivar los 2 organismos.

Para la realización del método de la invención, los pasos (a) y (b) pueden ser llevados a cabo de forma simultanea o secuencial, es decir, se puede llevar a cabo un cultivo del organismo del genero Coriolopsis y tras un tiempo de crecimiento añadir el organismo del género Penicillium y llevar a cabo el co-cultivo, o bien se puede añadir el organismo del género Penicillium en el mismo momento de inocular el organismo del género Coriolopsis y por tanto llevar a cabo el co-cultivo desde el primer instante de crecimiento. En la presente invención se demuestra que la adición del género Penicillium 3 días después de empezar el cultivo del organismo del género Coriolopsis produce une mejora en la producción de actividad lacasa. Por ello, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) , el organismo del género Penicillium se añade 3 días después de iniciar el cultivo del paso (a) .

En la presente invención también se demuestra que la adición de un organismo del género Penicillium 6 días después de empezar el cultivo del organismo del género Coriolopsis produce una mejora adicional en la producción de actividad lacasa. Por ello en otra realización más preferida de este aspecto de la invención, en el paso (b) , el organismo del género Penicillium se añade 6 días después de iniciar el cultivo del paso (a) .

Tanto el cultivo de los organismos de los géneros Coriolopsis y Penicillium como el co-cultivo pueden ser llevados a cabo en multitud de medios diferentes que son ampliamente utilizados para el crecimiento de hongos, y que son conocidos por experto en la materia, como por ejemplo, aunque sin limitarse, CMA, Czapek, MA, MEA, MB, PCA, PDA, PDB, PDYA, Sabouraud o XH descritos en Collins and Lyne’s Microbiological Methods, 1995, Butterworth-Heinemann; Hawksworth and Kirsop, 1988, Cambridge University Press.

Por otro lado, debido a la alta resistencia de los hongos, el co-cultivo de ambos organismos se puede llevar a cabo en diferentes condiciones de temperatura sin que afecte a las características del mismo. Por tanto, el co-cultivo se puede realizar a temperaturas como por ejemplo, aunque sin limitarse, de entre 15º y 35ºC. En una realización preferida, el co-cultivo se lleva a cabo a una temperatura de entre 20º y 30ºC. En una realización más preferida el cultivo se lleva a cabo a una temperatura de 28ºC.

En la presente invención se muestra... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción incrementada de lacasa en un organismo del género Coriolopsis que comprende cocultivar dicho organismo junto con otro organismo del género Penicillium.

2. Método según la reivindicación 1 que comprende los pasos: a) cultivar un organismo del género Coriolopsis b) añadir al cultivo del paso (a) un organismo del género Penicillium, y c) co-cultivar ambos organismos.

3. Método según la reivindicación 2 donde el organismo del paso (b) se añade 3 días después de iniciar el cultivo del paso (a) .

4. Método según la reivindicación 2 donde el organismo del paso (b) se añade 6 días después de iniciar el cultivo del paso (a) .

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones2a4 donde el co-cultivo se realiza en condiciones estáticas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones2a5 donde el co-cultivo se realiza durante al menos 12 días.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones2a5 donde el co-cultivo se realiza durante al menos 18 días.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones2a5 donde el co-cultivo se realiza durante al menos 21 días.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 donde el método comprende un paso adicional d) que consiste en la purificación de la lacasa.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a9 donde el organismo del género Coriolopsis se selecciona de la lista que comprende: Coriolopsis aspera, Coriolopsis byrsina, Coriolopsis caperata, Coriolopsis gallica, Coriolopsis polyzona, Coriolopsis rigida o Coriolopsis sanguinaria.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a10 donde el organismo del género Coriolopsis es Coriolopsis rigida.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones1a11 donde el organismo del genero Penicillium es Penicillium commune.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)

<120> Método para el incremento de la producción de lacasa en Coriolopsis mediante un inductor biológico <130> ES1641.701

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador ITS1

<400> 1 tccgtaggtg aacctgcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220>

<223> Cebador ITS4

<400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20