Método para el cribado ultrarrápido de poblaciones de transposón etiquetado e identificación masiva de la secuencia en paralelo de los sitios de inserción.

Método para la identificación de una inserción asociada a un gen o fenotipo de interés en un miembro deuna población de transposones,

que comprende las etapas de:

(a) aislar, individualmente o en mezclas, el ADN genómico de miembros de la población detransposones;

(b) realizar la restricción del ADN utilizando una o más endonucleasas de restricción, realizar laligación de los adaptadores con los fragmentos de restricción para preparar de este modo losfragmentos de restricción ligados a adaptadores;

(c) realizar la amplificación de los fragmentos de restricción ligados a adaptadores con un par decebadores, con lo que uno de los cebadores comprende una sección que es complementaria a partede una secuencia de transposón conocida, siendo el otro cebador por lo menos complementario aladaptador, comprendiendo uno o ambos cebadores una etiqueta para correlacionar el cebador y elproducto de amplificación con el miembro original de la población;

(d) determinar por lo menos parte de la secuencia de nucleótidos de por lo menos parte de losfragmentos de (c) utilizando la secuenciación ultrarrápida;

(e) identificar uno o más fragmentos de la etapa (d) que se puedan alinear con las secuencias denucleótidos de una base de datos, correlacionando de este modo los fragmentos identificados con ungen o fenotipo de interés;

(f) identificar el/los miembro(s) de la población de transposones que comprenden el/los fragmento(s)de la etapa (e).

Método para el cribado ultrarrápido de poblaciones de transposón etiquetado e identificación masiva de la secuencia en paralelo de los sitios de inserción.

Campo de la invención La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética. La presente invención se refiere a estrategias mejoradas para identificar mutantes de genes en poblaciones, basándose en la utilización de técnicas de secuenciación ultrarrápida.

Antecedentes de la invención En la investigación genómica actual en vegetales se utilizan poblaciones de transposones marcados para identificar los genes que afectan a rasgos de importancia agronómica o general mediante métodos de genética inversa.

Suponen herramientas complementarias para el descubrimiento de genes, ya que las poblaciones de transposones se utilizan habitualmente para identificar el gen responsable de un fenotipo observado, el método denominado genética directa. Este se distingue en la técnica del método de genética inversa en que se identifican las mutaciones en secuencias (genes) de interés. La etapa limitante de dichos métodos es el trabajo de cribado relacionado con la identificación del individuo que presenta una mutación en el gen o secuencia de interés. A continuación, se describen más detalladamente los principios de las poblaciones de transposones y los métodos de cribado y se presentan métodos de cribado más eficientes que aumentan el valor de dichas herramientas en el descubrimiento de genes.

Los transposones son elementos genéticos móviles que se producen, de un modo natural o por genomanipulación, en una pluralidad de copias en el genoma. Son inestables ya que su posición en el genoma puede cambiar por escisión e inserción en sitios nuevos, por lo general en cualquier momento dado del ciclo de vida. Las poblaciones de transposones son valiosas en el descubrimiento de genes ya que pueden alterar la función genética si se insertan en las secuencias de genes o en sus regiones reguladoras. Se conocen las secuencias de muchos transposones utilizadas en la reproducción de vegetales, pero una vez que se observa una planta con un fenotipo interesante, se desconoce qué gen se ve afectado por la inserción de un transposón. En general, se desconoce asimismo si, y en caso afirmativo, que transposón es el responsable del fenotipo. Dependiendo del organismo y del transposón, el número de copias de transposones en las poblaciones de transposones varía de varias decenas a cientos de transposones por planta.

Los métodos actuales de cribado para analizar secuencias mutantes fenotípicas provocadas por transposones comprenden métodos relacionados con la PCR mediada por ligación para obtener las secuencias flanqueadoras de los sitios de integración del transposón específicos de la secuencia. Una limitación de la PCR mediada por ligación es que la determinación de las secuencias flanqueadoras requiere la escisión de bandas a partir de geles de secuenciación, lo que resulta lento, difícil de automatizar y con un rendimiento relativamente bajo (no se puede adaptar fácilmente a miles de bandas) (Salland et al. 2003, Theor.Appl.Genet. 106: 1396-1408) . Se mejorará el cribado de poblaciones de transposones si se dispone de un método para recoger secuencias flanqueadoras de todos o por lo menos una parte de los transposones, integradas en el genoma. Pretendemos proporcionar un método eficaz para analizar y utilizar las inserciones en secuencias preferidas.

Definiciones En la siguiente descripción y ejemplos se utilizan diversos términos. Para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, comprendiendo el alcance que debe darse a dichos términos, se proporcionan las definiciones siguientes. Excepto si se indica lo contrario en la presente memoria, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto ordinario en la materia a la que pertenece la presente invención.

Transposón: Los transposones son secuencias de ADN que se pueden desplazar a distintas posiciones dentro del genoma de una célula simple, un proceso denominado transposición. En el proceso, se producen mutaciones y cambios en la cantidad de ADN del genoma. Los transposones se denominan asimismo "genes saltadores" o "elementos genéticos móviles". Existen diversos elementos genéticos móviles; se pueden agrupar en función de su mecanismo de transposición. Los elementos genéticos móviles de clase I, o retrotransposones, se desplazan en el genoma al transcribirse a ARN y vuelven de nuevo al ADN mediante la transcriptasa inversa, mientras que los elementos genéticos móviles de clase II se desplazan directamente de una posición a otra dentro del genoma utilizando una transposasa para "cortar y pegar" los mismos en el genoma. La transposición puede ser replicativa, en la que una copia del elemento transponible permanece en el sitio donador y otra se inserta en el sitio diana; o la transposición se puede realizar de un modo conservador, en el que el elemento transponible se escinde de un sitio y se inserta en otro. El término comprende, pero son limitarse a los mismos, elementos transponibles que se

encuentran en procariotas, tales como secuencias de inserción (IS) , transposones (Tn) o bacteriófagos tales como Mu y D108. Los elementos transponibles eucariotas comprenden, pero sin limitarse a los mismos: los elementos copia tales como los que se encuentran en D. melanogaster; los elementos TY tales como los que se encuentran en la levadura; los elementos transponibles Ta1 y Tnt 1 tales como los que se encuentran en Arabidopsis; los IAP que se encuentran en ratones; los elementos transponibles Tam o Cin tales como los que se encuentran en la boca de dragón, y los elementos transponibles AC, Spm, Bs, Cin, Dt y Mutator tales como los que se encuentran en el maíz. El término comprende asimismo elementos transponibles sintéticos que pueden insertarse ya sea de un modo replicativo o conservador en un genoma hospedador y cuya transposición o escisión del genoma se puede controlar mediante la intervención humana. Por ejemplo, se puede construir un elemento transponible sintético que carezca de una transposasa funcional (la enzima que interviene en la transposición) , sino que se suministre en trans mediante el enlace funcional del gen de la transposasa con un promotor inducible. Población de transposones: población individual de un organismo (por lo general vegetales, pero son posibles asimismo otros organismos, tales como la Drosophila y el ratón) , en la que cada uno de los mismos presenta una pluralidad de transposones en su genoma y cada uno de dichos transposones puede afectar a uno o más genes, con lo que se obtienen distintos fenotipos. Normalmente las poblaciones de transposones se pueden obtener seleccionándose a partir de individuos o variedades que expresen la inestabilidad en una característica fenotípica. Las poblaciones de transposones pueden presentar un tamaño muy variable y, para ciertos fines, se pueden utilizar poblaciones parciales que contengan el 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o incluso únicamente el 20% de la población original.

Etiqueta: secuencia corta que se puede añadir a un cebador o incluir en la secuencia del mismo o utilizar de algún otro modo como marcador para proporcionar un identificador único. Dicho identificador de la secuencia puede ser una secuencia de bases única de longitud variable pero definida utilizada únicamente para identificar una muestra específica de ácido nucleico. Por ejemplo las etiquetas de 4 pb permiten 4 (exp4) = 256 etiquetas distintas. Los ejemplos típicos son las secuencias ZIP, conocidas en la técnica (Iannone et al. Cytometr y 39:131-140, 2000) . Utilizando dicha etiqueta se puede determinar el origen de una muestra de PCR mediante procesamiento adicional. En el caso de combinar productos elaborados procedentes de muestras distintas de ácido nucleico, se identifican generalmente las muestras diferentes de ácido nucleico utilizando etiquetas distintas. En el caso de la presente invención, la adición de una etiqueta de secuencia única permite identificar las coordenadas del vegetal en particular en la mezcla de secuencias de los productos de amplificación. Se pueden utilizar etiquetas múltiples.

Etiquetado: se refiere al proceso de la adición de una etiqueta o marcador a un ácido nucleico para poder distinguir el mismo de un segundo o más ácidos nucleicos. El etiquetado se puede realizar, por ejemplo, añadiendo un identificador de la secuencia durante la amplificación utilizando cebadores etiquetados o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica.

Endonucleasa de restricción: una endonucleasa de restricción o enzima de restricción... [Seguir leyendo]

1. Método para la identificación de una inserción asociada a un gen o fenotipo de interés en un miembro de una población de transposones, que comprende las etapas de:

(a) aislar, individualmente o en mezclas, el ADN genómico de miembros de la población de transposones;

(b) realizar la restricción del ADN utilizando una o más endonucleasas de restricción, realizar la ligación de los adaptadores con los fragmentos de restricción para preparar de este modo los fragmentos de restricción ligados a adaptadores;

(c) realizar la amplificación de los fragmentos de restricción ligados a adaptadores con un par de cebadores, con lo que uno de los cebadores comprende una sección que es complementaria a parte de una secuencia de transposón conocida, siendo el otro cebador por lo menos complementario al adaptador, comprendiendo uno o ambos cebadores una etiqueta para correlacionar el cebador y el producto de amplificación con el miembro original de la población;

(d) determinar por lo menos parte de la secuencia de nucleótidos de por lo menos parte de los fragmentos de (c) utilizando la secuenciación ultrarrápida;

(e) identificar uno o más fragmentos de la etapa (d) que se puedan alinear con las secuencias de nucleótidos de una base de datos, correlacionando de este modo los fragmentos identificados con un gen o fenotipo de interés;

(f) identificar el/los miembro (s) de la población de transposones que comprenden el/los fragmento (s) de la etapa (e) ;

2. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (a) el ADN obtenido se mezcla posteriormente.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que en la etapa (c) los productos amplificados se mezclan posteriormente para crear una genoteca de productos de amplificación.

4. Método según la reivindicación 3, en el que la genoteca de productos de amplificación de la etapa (c) se fragmenta posteriormente.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en la etapa (d) la secuencia de los fragmentos se recorta informáticamente para eliminar de este modo cualquier adaptador e/o información de la secuencia relacionada con el transposón.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa (b) se utilizan dos o más, preferentemente dos, endonucleasas de restricción.

7. Método según la reivindicación 6, en el que en la etapa (b) preferentemente por los menos una de las endonucleasas de restricción es una endonucleasa de restricción de corte frecuente que no corta en transposones y por lo menos una de las endonucleasas de restricción es una endonucleasa de restricción de corte raro que corta en transposones.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que uno de los cebadores de la etapa (c) comprende además un sitio de enlace con un cebador de la secuencia.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se etiquetan los cebadores de la etapa (c) .

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la etapa adicional (g) de diseñar una sonda o par de cebadores de PCR basándose en los fragmentos de la etapa (e) y utilizarla para confirmar la inserción del transposón en el gen de interés del genoma del miembro identificado en (f) .

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la mezcla comprende una estrategia de mezcla 3D.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la base de datos comprende secuencias EST, secuencias genómicas de las especies de interés y/o la base de datos de secuencias no redundantes de GenBank o bases de datos de secuencias similares.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuenciación ultrarrápida es una secuenciación por síntesis, preferentemente una pirosecuenciación.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la secuenciación se realiza sobre un soporte sólido tal como una perla.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la secuenciación comprende las etapas de:

5 - hibridar fragmentos ligados a adaptadores de secuenciación con perlas, hibridándose cada perla con un único fragmento;

- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de

agua en aceite una única perla;

- realizar la PCR en emulsión para amplificar fragmentos ligados con adaptadores en la superficie de

10 las perlas - seleccionar / enriquecer las perlas que comprenden fragmentos amplificados ligados a adaptadores

- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una única perla; y

- generar una señal de pirofosfato.

15 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que por lo menos uno de los cebadores comprende uno o más nucleótidos con una afinidad de enlace mejorada.

Inserción NH3 enla planta (2, 12, 30)

Posición de la inserción Posición de la inserción

de la mezcla totalde 3D total