Método para determinar la probabilidad de contraer una infección por VIH.

La presente invención está dirigida a métodos para determinar la probabilidad de que un sujeto se infecte por VIH o se convierta en un paciente sin progresión a largo plazo tras la exposición a VIH basados en la determinación del número de copias del gen DEFA1A3.

Asimismo, la presente invención se relaciona con kits que comprenden reactivos adecuados para la determinación del número de copias del gen DEFA1A3.

Método para determinar la probabilidad de contraer una infección por VIH

Campo de la invención La invención se refiere a un método y un kit diagnóstico para identificar sujetos capaces de controlar la evolución del VIH o prevenir la infección por VIH del todo.

Antecedentes de la invención La resistencia innata a la infección por VIH es rara y muy variable entre diferentes individuos. A pesar de este hecho, algunos individuos se exponen al virus VIH pero permanecen sin infectar.

La mayor secreción de α-defensinas 1-3 (HNP 1-3) por las células dendríticas (CD) en individuos infectados por VIH se ha mostrado asociada con una menor velocidad de progresión a SIDA. Véase, Rodríguez-García M, et al., PLoS ONE 2010; 5 (2) :e-9436. Las defensinas son péptidos antimicrobianos endógenos naturales con potente actividad anti-VIH. Según características estructurales, existen dos familias de defensinas en seres humanos, αy β-defensinas, ambas con actividad anti-VIH. Los neutrófilos son la principal fuente celular de α-defensinas (es decir, péptidos de neutrófilos humanos HNP-1 y HNP-3) , aunque otros subconjuntos de leucocitos también las producen. Aparte de su efecto directo anti-VIH, las α-defensinas 1-3 muestran múltiples actividades inmunoestimulantes, incluyendo quimioatracción de células T indiferenciadas y células dendríticas inmaduras (CDin) , inducción de la producción de citoquinas y quimioquinas y modulación de la expresión de receptores y correceptores de VIH

Los individuos que están expuestos al virus VIH pero permanecen sin infectar (expuestos a VIH no infectados, EU) y los pacientes sin progresión a largo plazo expresan cantidades significativamente mayores de defensinas, tales como α-defensinas, que los que evolucionan a SIDA. Véase, Rodríguez-García, 2010, anteriormente. Este factor se ha usado para determinar el estado de infección por VIH ensayando los niveles de varios polipéptidos de α-defensina (por ejemplo, ELISA, SELDI) en el cuerpo. Sin embargo, estos métodos son inexactos, requieren tiempo y utilizan reactivos caros tales como anticuerpos.

Según esto, hay una necesidad en la técnica para métodos alternativos para la identificación de pacientes que son resistentes a infección por VIH que superen las deficiencias de los métodos conocidos en el estado de la técnica.

Breve compendio de la invención La presente invención muestra que el número de copias del gen DEFA1A3 es mayor en individuos expuestos a VIH que permanecen sin infectar o que se convierten en pacientes sin progresión a largo plazo en comparación con sujetos que desarrollan la enfermedad.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar la probabilidad de que un sujeto se infecte por VIH o se convierta en paciente sin progresión a largo plazo tras la exposición al VIH

que comprende evaluar la variación en el número de copias de DEFA1A3 en una muestra biológica de dicho sujeto; en donde un número de copias de DEFA1A3 aumentado con respecto a un valor de referencia es indicativo de una probabilidad aumentada de que el sujeto no se infecte o se convierta en un paciente sin progresión a largo plazo si se infecta; o en donde un número de copias de DEFA1A3 disminuido con respecto a un valor de referencia es indicativo de una probabilidad aumentada de que el sujeto se infecte o se convierta en un paciente crónico con progresión.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método in vitro de seleccionar una terapia para una infección por VIH o para una enfermedad asociada con una infección por VIH para un sujeto que comprende evaluar la variación en el número de copias de DEFA1A3 en una muestra biológica de dicho sujeto en donde si el sujeto 55 muestra un número de copias de DEFA1A3 disminuido con respecto a una muestra de referencia se selecciona una terapia del grupo que consiste en terapia antirretroviral de gran activad (TARGA) , inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión, inhibidores de integrasa, inhibidores de transcriptasa inversa y terapia de vacuna con un inmunógeno de VIH.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit que comprende reactivos adecuados para detectar una variación en el número de copias de DEFA1A3.

En un último aspecto, la invención se refiere al uso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) , inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión, inhibidores de 65 integrasa, inhibidores de transcriptasa inversa y terapia de vacuna para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de SIDA o de una enfermedad asociada con la infección por VIH en un sujeto que ha estado expuesto a VIH, en donde dicho sujeto muestra un número de copias de DEFA1A3 disminuido con respecto a un valor de referencia.

Diagramas Figura 1. CDi de individuos EU que muestran una secreción aumentada de HNP 1-3. Los individuos EU indujeron una producción 2 veces significativamente mayor de HNP 1-3 comparados con los sanos (p < 0, 01) . Los pacientes de VIH indujeron una producción 1, 5 veces mayor de HNP 1-3 comparados con los individuos sanos.

Figura 2. A. Los individuos EU poseen una VNC de DEFA1A3 significativamente mayor. B. Los individuos EU poseen una VNC de DEFA1A3 significativamente mayor comparados tanto con individuos sanos como con pacientes de VIH (p < 0, 05) .

Figura 3. Tinción intracelular en CDi de HNP 1-3 de un individuo EU con 10 VNC. Las CDi de un individuo EU de 10 VNC produjo la mayor cantidad de HNP 1-3. A. Citometría de flujo. B. inmunofluorescencia. Las proteínas HNP 1-3 se localizan en el citoplasma y se acumulan en gránulos cerca del núcleo.

Figura 4. La secreción de HNP 1-3 y citoquinas se asocia con una VNC de DEFA1A3 alta en individuos sanos.

Figura 5. La VNC de DEFA1A3 alta se correlaciona positivamente con HNP 1-3 secretadas por CDi. Se encontró una correlación significativa entre la VNC de DEFA1A3 y HNP 1-3 secretadas por CDi en individuos sanos (Pearson p < 0, 05) .

Figura 6. CDi pulsadas con VIH cocultivadas con linfocitos autólogos de individuos sanos con una VNC de DEFA1A3 elevada. Los ensayos de transinfección funcional usando CD infectadas con VIH mostraron una protección a VIH 5 veces mayor en individuos con VNC alta comparados con individuos con VNC baja.

Descripción detallada de la invención La presente invención muestra que la VNC de DEFA1A3 en individuos expuestos a VIH que permanecen sin infectar es mayor que en sujetos sanos. Además, la infección de PBMC con células dendríticas infectadas con VIH se produce a una eficacia mucho menor en células aisladas de pacientes que tienen un número de copias aumentado del gen DEFA1A3. Por tanto, la invención resuelve una necesidad de hace mucho tiempo en la técnica proporcionando composiciones y un método para determinar la probabilidad de contraer una infección por VIH basándose en la determinación del número de copias del gen DEFA1A3 en el locus de la VNC de DEFA1A3. Este método es más preciso, rápido y fácil de llevar a cabo que otros métodos comparables. El método también podría ser útil para diseñar y seguir el tratamiento de SIDA y enfermedades asociadas con la infección por VIH, tal como TAR, TARGA y vacunas de células dendríticas.

1. Definiciones El término “α-defensina”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido cuya actividad biológica se caracteriza por tener actividad anti-VIH. Las α-defensinas generalmente tienen menos de 100 aminoácidos de longitud, habitualmente aproximadamente 25-35 aminoácidos de longitud, caracterizadas por seis residuos de cisteína en un motivo que está conservado entre especies. Véase, Liu L, et al., Genomics 1997; 43:316-320 y Lehrer R, et al., documento US 4.705.777. Las α-defensinas también tienen una carga positiva neta a pH fisiológico, generalmente atribuible a argininas cargadas positivamente. Se han encontrado α-defensinas en neutrófilos humanos, de conejo, cobaya, rata, macaco y hámster, en macrófagos alveolares de conejo, y en células de Paneth del intestino delgado humano y de roedores. Véase, Daher K, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 1988, 85:7327-7331, Lehrer R, et al., Infect. Immun. 1975; 11:1226-1234, Selsted M, et al., Infect. Immun. 1984; 55:2181-2186, Eisenhauer P, et al., Infect. Immun. 1989; 57:2021-2027, Tang Y, et al., Infect. Immun. 1999; 67:6139-6144, Mak P, et al., Infect. Immun. 1994; 64:4444-4449, Ganz T, et al., J. Immunol. 1990; 143:13581365, Mallow E., et al., J. Biol. Chem. 1996; 271:4038-4045, Ouellette A, et al., J. Cell. Biol. 1989; 108:16871695, y Qu X, et... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la probabilidad de que un sujeto se infecte por VIH o se convierta en un paciente sin progresión a largo plazo tras la exposición al VIH que comprende evaluar la variación en el número de copias de DEFA1A3 en una muestra biológica de dicho sujeto;

en donde un número de copias de DEFA1A3 aumentado con respecto a un valor de referencia es indicativo de una probabilidad aumentada del sujeto de no infectarse o de convertirse en un paciente sin progresión a largo plazo si se infecta; o, en donde un número de copias de DEFA1A3 disminuido con respecto a un valor de referencia es indicativo de una probabilidad aumentada de que el sujeto se infecte o de que se convierta en un paciente crónico con progresión.

2. Un método in vitro de seleccionar una terapia para la infección por VIH o para una enfermedad asociada con la infección por VIH para un sujeto que comprende evaluar la variación en el número de copias de DEFA1A3 en una muestra biológica de dicho sujeto en donde si el sujeto muestra un número de copias de DEFA1A3 disminuido con respecto a una muestra de referencia, se selecciona una terapia del grupo que consiste en terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) , inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión, inhibidores de integrasa, inhibidores de transcriptasa inversa y terapia de vacuna con un inmunógeno de VIH.

3. El método in vitro según las reivindicaciones 1 o 2 en donde un número de copias aumentado con respecto a un valor de referencia indica al menos 5 copias o un número de copias disminuido con respecto a un valor de referencia indica menos de 5 copias.

4. El método in vitro según la reivindicación 3 en donde un número de copias aumentado con respecto a un valor de referencia indica al menos 9 copias o un número de copias disminuido con respecto a un valor de referencia indica menos de 9 copias.

5. El método in vitro según las reivindicaciones 1 o 2 en donde se usa el gen DEFB1 o el gen RNasa-P como referencia.

6. El método in vitro según las reivindicaciones 1 a 5 en donde la evaluación de la variación en el número de copias de DEFA1A3 se lleva a cabo mediante qRT-PCR.

7. El método in vitro según la reivindicación 6 en donde los cebadores de amplificación de PCR en la qRT-PCR comprenden las secuencias de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:17.

8. El método in vitro según la reivindicación 7 en donde la sonda de detección usada en la qRT-PCR comprende las secuencias de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:18.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde la variación en el número de copias de DEFA1A3 es una variación en el alelo DEFA1 y/o en el alelo DEFA3.

10. El método según la reivindicación 9 en donde la determinación del número de copias de los alelos DEFA1 y DEFA3 se lleva a cabo mediante pirosecuenciación.

11. El método según la reivindicación 10 en donde los cebadores de amplificación de PCR usados en la pirosecuenciación comprenden las secuencias SEQ ID NO:13 y SEQ ID:14.

12. El método según la reivindicación 11 en donde el cebador de secuenciación usado en la reacción de pirosecuenciación comprende la secuencia de SEQ ID NO:15.

13. Un kit que comprende reactivos adecuados para detectar una variación en el número de copias de DEFA1A3.

14. El kit según la reivindicación 13 en donde dichos reactivos incluyen un primer conjunto de cebadores adecuados para la amplificación de una región en el gen DEFA1A3 y al menos una sonda capaz de hibridar con la región dentro del gen DEFA1A3 que se ha amplificado usando los cebadores.

15. El kit según la reivindicación 14 en donde los cebadores comprenden las secuencias de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:17.

16. El kit según las reivindicaciones 14 o 15 en donde la sonda comprende la secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:18.

17. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que comprende además un segundo conjunto de cebadores adecuados para la amplificación de una región dentro de la región del gen DEFA1A3 amplificada con el primer par de cebadores.

18. El kit según la reivindicación 17 en donde los cebadores del segundo conjunto de cebadores comprenden las secuencias de SEQ ID NO:13 y SEQ ID:14.

19. El kit según las reivindicaciones 13 a 18 que comprende además un cebador de secuenciación adecuado 10 para distinguir el gen DEFA1 del gen DEFA3.

20. El kit según la reivindicación 19 en donde el cebador de secuenciación comprende la secuencia de SEQ ID NO.15.