Método para analizar cuantitativamente un microorganismo eligiendo como diana un ARNr.

Un método para cuantificar un microorganismo de interés en estado vivo,

utilizando como índice una cantidad de ARNr de un microorganismo de interés en un espécimen que se va a someter a ensayo, en donde el método comprende medir un producto amplificado mediante una RT-PCR realizada utilizando fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridar específicamente con el ARNr del microorganismo de interés y una muestra del espécimen que se va a someter a ensayo

Método para analizar cuantitativamente un microorganismo eligiendo como diana un ARNr

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de cuantificación o detección de un microorganismo, en estado vivo, eligiendo como diana ARNr.

Técnica anterior

Como método de cuantificación de un microorganismo, se han utilizado convencionalmente principalmente un método que implica el cultivo de un microorganismo en un medio de selección estimado preliminarmente y la medición del número de células microbianas y un método que implica el cultivo de un microorganismo en un medio de selección líquido y la medición de la densidad óptica o la absorbancia. Los métodos siguientes también se han utilizado para la operación de identificación de un microorganismo necesaria en la detección de microorganismos en un espécimen, por ejemplo, un método que implica la identificación de los mismos a través de la observación morfológica, tinción de Gram, y características microbiológicas tales como el requerimiento de oxígeno, las propiedades de asimilación de azúcar y las condiciones de crecimiento en un medio; un método que implica la determinación de los mismos mediante una prueba de homología de ADN-ADN; y un método de detección que utiliza un anticuerpo monoclonal contra un antígeno de superficie microbiano. Sin embargo, estos métodos requieren tiempo y conocimiento práctico y por lo tanto, han presentado un problema desde un punto de vista de la rapidez y la simplicidad.

En los últimos años, los métodos de amplificación de genes incluyendo un método de PCR se han utilizado en una amplia gama de campos como técnicas para la detección de vestigios de ácidos nucleicos. Estos métodos tienen ventajas capaces de conducir a la aceleración y la simplificación, incluyendo ningún requisito obligatorio para el cultivo de un microorganismo contenido en un espécimen y la capacidad de manipular directamente un espécimen como una muestra. Por lo tanto, los métodos han sido sometidos a la investigación de la aplicación a la cuantificación y la detección de un microorganismo.

Como un ejemplo en el que el método de PCR se ha aplicado al análisis de un microorganismo, se conoce un método para la cuantificación de una bacteria mediante un método de PCR que utiliza el ADN total como secuencia diana y cebadores universales (Documento de Patente 1) . También se han conseguido métodos que utilizan ADNr 16S como diana. Los ejemplos conocidos de los mismos incluyen un método para el análisis cuantitativo mediante un método de PCR usando ADNr 16S como secuencia diana (Documento de Patente 2) , un método para el análisis de una bacteria intestinal mediante un método de PCR usando ADNr 16S como secuencia diana (Documento de Patente 3) , y un método para la detección de una cepa bacteriana del género Lactobacillus, una bacteria que causa turbidez de la cerveza (Documento de Patente 4) . Sin embargo, estos métodos han tenido el problema de que no pueden ser utilizados como alternativas a un método convencional que se ha empleado convencionalmente debido a que no se logra la sensibilidad de detección en la medida obtenida con el método de cultivo. A modo de ejemplo, la realización del método para el análisis cuantitativo como se describe en el documento de Patente 2 requiere una gran cantidad de ADN molde que corresponde a un recuento microbiano de 105/µl o más, lo que hace que el método no sea práctico. La baja sensibilidad de detección se debe probablemente al bajo número de copias (cantidad de molde) , del ADN total o ADNr 16S que se proporciona como molde para la PCR en el microorganismo. Puesto que se sabe que el ADN permanece incluso después de la muerte de un microorganismo, estos métodos sólo cuantifican y detectan microorganismos vivos y muertos juntos, lo que también ha planteado el problema de que es difícil de cuantificar y detectar con precisión un microorganismo en estado vivo ( Documento no de patente 1) .

Como ejemplos de aplicación de un método de PCR para el análisis de un microorganismo, también se han realizado intentos para llevar a cabo los métodos utilizando ARNm como secuencia diana; los ejemplos conocidos de los mismos incluyen el análisis cuantitativo de una bacteria de ácido láctico en las heces, empleando ARNm como secuencia diana (Documento no de Patente 2) . También se conocen métodos para detectar células cancerosas que utilizan como secuencias diana ARNm específicos para las células cancerosas en los especímenes (Documentos de Patente 5 y 6) . Sin embargo, incluso estos métodos no han proporcionado la sensibilidad de detección en la medida en que puedan reemplazar el método convencional como métodos de cuantificación. Específicamente, el límite de detección del análisis cuantitativo como se muestra en el Documento de Patente 2 es sólo 103, 5 o más células/g de heces; el método de análisis no ha sido susceptible de ser utilizado como una alternativa al método de cultivo convencional en vista de la sensibilidad de detección. Además, estos métodos eligen como diana ARNm de genes únicos a los microorganismos, y han sido inadecuados para la detección en un espécimen que se va a someter a ensayo que contiene una gran variedad de microorganismos debido a problemas tales como el complicado diseño del cebador y la reducida especificidad.

En consecuencia, se ha esperado el desarrollo de un método que proporcione la sensibilidad de detección en la misma medida que los métodos de detección convencionales, a la vez que sea un método rápido utilizando un método de PCR o similares y que adicionalmente pueda cuantificar y detectar con precisión un microorganismo en estado vivo. Para mejorar la sensibilidad, es posible cambiar el diseño de una diana de modo que la diana pueda estar presente de manera más estable o más en abundancia en las células. Sin embargo, tal diana estable es probablemente desfavorable para el propósito de detectar sólo un microorganismo vivo, teniendo en cuenta que se sospecha que también permanece mucho tiempo en una de sus células muertas. Por lo tanto, no es fácil de conseguir de forma simultánea la detección sólo de células vivas y la sensibilidad de detección suficientemente alta.

Además, se ha sabido que el ARNr representa aproximadamente 85% del contenido de ARN en una célula y tiene múltiples copias y que el ARNr es estable en comparación con el ARNm, ya que forma un complejo con la proteína. También se informó que el ARNr es detectado en el orden de 48 horas después de la muerte microbiana (Documento no de Patente 3) y por lo tanto se ha creído comúnmente que es inadecuado para la detección de un microorganismo en estado vivo (Documento no de Patente 1) .

Documento de Patente 1: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública 2002-238585

Documento de Patente 2: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública 2003-259879

Documento de Patente 3: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública 2001-112485

Documento de Patente 4: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública 10-210980

Documento de Patente 5: Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública 10-248600

Documento de Patente 6: Publicación Internacional WO 00/17395 folleto Documento no de Patente 1: J Food Prot, vol. 67, Núm. 4: 823-832 (2004)

Documento no de Patente 2: FEMS Microbiology Letters, vol. 231: 125-130 (2004)

Documento no de Patente 3: Appl. Environ. Microbiol., Vol. 64, Núm. 11: 4.264-4.268 (1.998)

Van der Vliet et al (Antimicrob. Agents Chemother., 1994, vol. 38, págs. 1959-1965) describieron un método para la evaluación de la viabilidad de micobacterias en una forma semi-cuantitativa utilizando NASBA. Centurion-Lara et al

(J. Clin. Microbiol., 1997, vol. 35, págs. 1348-1352) describieron la detección de Treponema mediante PCR de transcriptasa inversa, eligiendo como diana ARN 16S.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de un microorganismo, que pueda lograr la sensibilidad de detección en la medida que sea capaz de reemplazar un método de cultivo convencional y la detección más precisa del microorganismo en estado vivo.

Descripción de la invención Como resultado de estudios exhaustivos, los autores de la presente invención han encontrado que ARNr (es decir, 5S, 16S, y 23S en las bacterias, y 5S, 18S, 26S o 28S en células eucariotas) , que se creía que era inadecuado para la detección de un microorganismo vivo en términos de estabilidad, se puede utilizar inesperadamente como una diana para cuantificar y detectar con precisión el número de células microbianas en estado vivo sin la incorporación de sus células muertas y,... [Seguir leyendo]

1. Un método para cuantificar un microorganismo de interés en estado vivo, utilizando como índice una cantidad de ARNr de un microorganismo de interés en un espécimen que se va a someter a ensayo, en donde el método comprende medir un producto amplificado mediante una RT-PCR realizada utilizando fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridar específicamente con el ARNr del microorganismo de interés y una muestra del espécimen que se va a someter a ensayo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la medición del producto amplificado comprende identificar el número de ciclos de PCR cuando el producto amplificado alcanza una cierta cantidad.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende la medición del producto amplificado a lo largo del tiempo.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el espécimen que se va a someter a ensayo es un espécimen derivado de heces, un alimento, o un organismo.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ARNr del microorganismo de interés en la muestra del espécimen que se va a someter a ensayo se estabiliza en el microorganismo.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se cuantifica el número de células del microorganismo de interés.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridar específicamente con el ARNr del microorganismo de interés son cada uno un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de bases descrita en uno de los SEQ ID NO: 2, 3 y 5 a 28 o una secuencia de bases complementaria a la misma, o un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de bases homóloga a la misma y funcionalmente equivalente a la misma.

8. El uso de un fragmento de ácido nucleico para cuantificar un microorganismo de interés en un estado vivo mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento de ácido nucleico es un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de bases descrita en uno de los SEQ ID NO: 2, 3 y 5 a 28 o una secuencia de bases complementaria a la misma; el fragmento de ácido nucleico contiene la secuencia de bases representada por uno de los SEQ ID NOS: 2, 3 y 5 a 28 o una secuencia de bases complementaria a la misma, en donde el fragmento tiene una deleción, sustitución o adición de una o varias bases, el fragmento de ácido nucleico tiene una identidad de secuencia de 90% o más con la secuencia de bases representada por uno de los SEQ ID NOS: 2, 3 y 5 a 28 o una secuencia de bases complementaria a la misma; o el fragmento de ácido nucleico contiene una secuencia de bases capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el ADN que contiene la secuencia de bases representada por uno de los SEQ ID NOS: 2, 3 y 5 a 28 o una secuencia de bases complementaria a la misma.

9. El uso de un kit para cuantificar un microorganismo de interés en estado vivo mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho kit

(1) fragmento de ácido nucleico capaz de hibridas específicamente con ARNr de un microorganismo de interés, y/o

(2) un reactivo utilizado para la extracción de ARN, la estabilización de ARN, y/o una PCR.