Método mejorado de presentación de ARN.

Un método de exploración de una biblioteca de presentación de ARN de anticuerpos scFv,

comprendiendo elprocedimiento las etapas de:

(a) proporcionar una molécula de ARNm de Fv monocatenaria (scFv) reticulada con una puromicina, o con unanálogo de la misma, comprendiendo dicha molécula un ARNm que codifica un scFv 5' y una secuenciaespaciadora 3', cuya molécula está reticulada con un conector de ácido nucleico monocatenario, comprendiendoel conector una puromicina, o un análogo de la misma, en un extremo 3' y un Poraleno C6 en el extremo 5';

(b) traducir in vitro la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina en presencia de un marcador encondiciones levemente oxidantes para formar una molécula de ARNm de scFv reticulada conpuromicina/proteína marcada;

(c) purificar la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada;

(d) someter la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada purificada a unaselección por antígenos con al menos un antígeno; y

(e) recuperar las moléculas de ARNm de scFv reticuladas con puromicina/proteína marcadas purificadas usandoperlas magnéticas basadas en afinidad.

Método mejorado de presentación de ARN

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a la presentación de ARN, y particularmente a métodos de presentación de ARN que permiten realizar la selección de antígenos solubles y de superficie celular.

Antecedentes de la invención Pueden seleccionarse anticuerpos que se unan con alta especificidad y afinidad a casi cualquier epítopo estructural y se usan rutinariamente como herramientas de investigación y como agentes terapéuticos autorizados por la FDA (Food and Drug Administration) . Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales terapéuticos y de diagnóstico constituyen un mercado mundial multimillonario.

Los métodos clásicos de inmunización de animales para obtener anticuerpos son lentos y engorrosos. Como consecuencia, se han desarrollado métodos para la selección ex vivo de un anticuerpo contra una molécula diana deseada usando bibliotecas de anticuerpos sintéticos. En algunos métodos, las bibliotecas de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se presentan en la superficie de un organismo, (por ejemplo, un bacteriófago, un virus, una célula de levadura, una célula bacteriana o célula de mamífero) , y el organismo se selecciona para la expresión del anticuerpo deseado. En otros métodos, las bibliotecas de anticuerpos se expresan y se seleccionan en un sistema acelular in vitro. En dicho sistema, denominado presentación de ARN, las proteínas o los péptidos expresados están unidos, de manera covalente o por interacción estrecha no covalente, a su ARNm codificante para formar moléculas de fusión de ARN/proteína. El componente proteico o peptídico de una fusión de ARN/proteína puede seleccionarse para unirse a una diana deseada y la identidad de la proteína o del péptido puede determinarse por secuenciación del componente de ARNm codificante unido.

Los sistemas actuales de presentación de ARN in vitro, aunque son buenos para expresar dominios variables de anticuerpos sencillos, son ineficaces para expresar anticuerpos multidominio, tales como moléculas de anticuerpo monocatenario (scFv, single chain Fv) . Esto se debe principalmente a las condiciones de reacción de los sistemas de expresión actuales in vitro y a la tendencia a perder el ADNc del scFv de longitud completa de la biblioteca a través de amplificación repetida por PCR.

Por tanto, en la técnica existe una necesidad de métodos de presentación in vitro mejorados para la selección de anticuerpos scFv contra una diana deseada.

Irving R. et al (Journal of immunological methods, Elsevier Science Publisher B. V.; Amsterdam, NL, vol. 248, no.1/02, 1 de febrero del 2001, páginas 31-45) es un artículo de revisión que aborda estrategias de presentación de fagos y de ribosomas para realizar la maduración por afinidad de las superficies de unión a antígeno en moléculas de scFv y dominios V. También desvela un método basado en un sistema acelular para la presentación de ribosomas, que incorpora una ARN polimerasa dependiente de ARN viral para la generación de bibliotecas mutantes al azar.

Kurz et al. (Nucleic Acids Research 15 de septiembre 2000, página E83) se refiere a un conector de Psoraleno C6 puromicicina que se utiliza para ligar el aceptor peptídico al ARN usando fotorreticulación.

Zhu (documento US 2006/0246515) se refiere a composiciones y métodos para generar y explorar anticuerpos contra un antígeno específico.

Sumario de la invención La invención resuelve los problemas anteriores proporcionando métodos mejorados de presentación de ARN in vitro para permitir la expresión y la selección fiable de moléculas de scFv a partir de bibliotecas de expresión. Sin 55 embargo, particularmente adecuados para la expresión y la selección de moléculas de scFv, los métodos de la invención son también convenientes para realizar la presentación in vitro de todas las clases de proteínas, incluyendo antígenos tanto solubles como de superficie celular.

Por consiguiente, la invención tiene diversas ventajas que incluyen, pero sin limitación, proporcionar métodos mejorados de presentación de ARN in vitro, que son más sencillos y menos lentos de realizar que los métodos previamente descritos. Adicionalmente, los métodos de la invención permiten mejorar la expresión funcional de proteínas que contienen enlaces disulfuro intracatenarios, por ejemplo, moléculas de anticuerpos scFv.

En un aspecto, la invención proporciona un método de exploración de una biblioteca de presentación de ARN de 65 anticuerpos scFv, comprendiendo el método las etapas de (a) proporcionar una molécula de ARNm de scFv reticulada con una puromicina o con un análogo de la misma, comprendiendo dicha molécula un ARNm que codifica un scFv 5’ y una secuencia espaciadora 3’, cuya molécula está reticulada con un conector de ácido nucleico monocatenario, comprendiendo el conector una puromicina, o un análogo de la misma, en un extremo 3’ y un Psoraleno C6 en el extremo 5’; (b) traducir in vitro la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina en presencia de un marcador en condiciones levemente oxidantes para formar una molécula de ARNm de scFv

reticulada con puromicina/proteína marcada; (c) purificar la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada; (d) someter la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada purificada a una selección por antígenos con al menos un antígeno; y (e) recuperar las moléculas de ARNm de scFv reticuladas con puromicina/proteína marcadas purificadas usando perlas magnéticas basadas en afinidad.

En una realización, el método comprende adicionalmente la etapa de (g) realizar la transcripción inversa del ARNm de scFv después de la selección por antígenos para producir un ADNc. En otra realización, el método comprende adicionalmente la etapa de (h) amplificar el ADNc.

En una realización, el marcador es un marcador radiactivo, tal como, por ejemplo, 35S metionina o cisteína.

En una realización, la secuencia espaciadora 3’ comprende de aproximadamente 0 a aproximadamente 200 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 16 aminoácidos, y/o la secuencia espaciadora 3’ comprende una etiqueta de afinidad.

En una realización, el conector comprende, de 5’ a 3’: Psoraleno C6, ribonucleótidos 2’OMe que comprenden la secuencia UAGCGGAUGC (SEC ID Nº: 20) , seis grupos de trietilenglicol o PEG-150, dos restos de citidina y puromicina.

En una realización, la molécula de ARNm de scFv está fotorreticulada con el conector de ADN por UVA, En otra realización, la molécula de ARNm de scFv comprende un promotor 5’ seleccionado del grupo que consiste en T7, SP6 y T3. En una realización particular, la molécula de ARNm de scFv comprende una región 5’ no traducida del virus del mosaico del tabaco.

En una realización, la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada se purifica por cromatografía con oligo-dT. En otra realización, la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada se purifica usando perlas de agarosa con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. En otra realización adicional, la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada se purifica por cromatografía con oligo-dT y perlas de agarosa con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.

En una realización, el antígeno es un péptido, una proteína o un hapteno marcado con biotina. En otra realización, el antígeno es una proteína de fusión con un fragmento cristalizable (Fc) de inmunoglobulina humana o con un fragmento cristalizable (Fc) de inmunoglobulina murina, o el antígeno es una población de células. En una realización particular, el anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti

hemaglutinina (anti-HA) , un anticuerpo murino o un anticuerpo humano.

En una realización, la traducción in vitro de la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina se realiza en presencia de GSSH/GSH.

En una realización, el método no comprende una etapa de protección de ARNm. En otra realización, el método no comprende una etapa de transcripción inversa in vitro antes de la etapa de purificación. En otra realización más antes, durante o después de cualquiera de las etapas (a) a (g) se añade un inhibidor de RNasa. En una realización, la etapa de purificación comprende realizar la transcripción inversa del ARNm en ausencia de ditiotreitol (DTT) para producir un ADNc.

En determinadas realizaciones, el ADNc se eluye por hidrólisis alcalina a un pH de aproximadamente =8, 0 a aproximadamente pH=10, 0. De manera alternativa, el ADNc se eluye... [Seguir leyendo]

1. Un método de exploración de una biblioteca de presentación de ARN de anticuerpos scFv, comprendiendo el

procedimiento las etapas de: 5

(a) proporcionar una molécula de ARNm de Fv monocatenaria (scFv) reticulada con una puromicina, o con un análogo de la misma, comprendiendo dicha molécula un ARNm que codifica un scFv 5’ y una secuencia espaciadora 3’, cuya molécula está reticulada con un conector de ácido nucleico monocatenario, comprendiendo el conector una puromicina, o un análogo de la misma, en un extremo 3’ y un Poraleno C6 en el extremo 5’;

(b) traducir in vitro la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina en presencia de un marcador en condiciones levemente oxidantes para formar una molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada;

(c) purificar la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada;

(d) someter la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada purificada a una 15 selección por antígenos con al menos un antígeno; y

(e) recuperar las moléculas de ARNm de scFv reticuladas con puromicina/proteína marcadas purificadas usando perlas magnéticas basadas en afinidad.

2. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende la etapa de (f) realizar la transcripción inversa del ARNm de scFv después de la selección por antígenos para producir un ADNc.

3. El método de la reivindicación 2, que adicionalmente comprende la etapa de (g) amplificar el ADNc.

4. El método de la reivindicación 1, donde el marcador es un marcador radioactivo, donde preferentemente el 25 marcador radioactivo es 35S metionina o cisteína.

5. El método de la reivindicación 1, donde la secuencia espaciadora 3’ comprende de aproximadamente 0 a aproximadamente 200 aminoácidos, o donde la secuencia espaciadora 3’ comprende aproximadamente 16 aminoácidos, o donde la secuencia espaciadora 3’ comprende una etiqueta de afinidad.

6. El método de la reivindicación 1, donde el conector de ácido nucleico comprende, de 5’ a 3’:

- Psoraleno C6; -ribonucleótidos 2’OMe que comprenden la secuencia UAGCGGAUGC (SEC ID Nº: 20) ;

-seis grupos de trietilenglicol o PEG-150; -dos restos de desoxicitidina; y -Puromicina.

7. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ARNm de scFv está fotorreticulada con el conector de ácido nucleico por UVA.

8. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ARNm de scFv comprende un promotor 5’ seleccionado del grupo que consiste en T7, SP6 y T3, o donde la molécula de ARNm de scFv comprende una región 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco.

9. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina/proteína marcada se purifica por cromatografía con oligodT, o usando perlas de agarosa con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2, o por cromatografía con oligodT y perlas de agarosa con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.

10. El método de la reivindicación 1, donde el antígeno es un péptido, una proteína, un hapteno marcado con biotina, una proteína de fusión con un fragmento cristalizable (Fc) de inmunoglobulina humana, una proteína de fusión con un fragmento cristalizable (Fc) de inmunoglobulina murina, o una población de células.

11. El método de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-HA, un 55 anticuerpo murino, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde

-adicionalmente se realiza una traducción in vitro de la molécula de ARNm de scFv reticulada con puromicina en presencia de GSSG/GSH, preferentemente donde adicionalmente se realiza una traducción in vitro de la molécula de ARNm de scFv reticulada con una puromicina en presencia de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) ; más preferentemente donde adicionalmente se realiza una traducción in vitro de la molécula de ARNm de scFv reticulada con una puromicina en ausencia de ditiotreitol; o

-adicionalmente se realiza una traducción in vitro de la molécula de ARNm de scFv reticulada con una puromicina en ausencia de ditiotreitol.

13. El método de la reivindicación 1, donde el método no comprende una etapa de protección de ARNm, o donde el método no comprende una etapa de transcripción inversa in vitro antes de la etapa de purificación.

14. El método de la reivindicación 1, donde antes, durante o después de cualquiera de las etapas (a) a (g) se añade 5 un inhibidor de RNasa.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicha etapa de purificación comprende la transcripción inversa del ARNm en ausencia de ditiotreitol para producir un ADNc.

16. El método de la reivindicación 2 o 15, donde el ADNc se eluye por hidrólisis alcalina a un pH de aproximadamente =8, 0 a aproximadamente un pH=10, 0, o donde el que el ADNc se eluye por calor, o donde el ADNc se eluye por un ácido a un pH de aproximadamente =3, 0 a aproximadamente pH=6, 0.

17. El método de la reivindicación 15, donde el ADNc se amplifica por reacción en cadena de la polimerasa. 15

18. El método de la reivindicación 17, donde la reacción en cadena de la polimerasa emplea una ADN polimerasa termoestable, o donde la reacción en cadena de la polimerasa emplea una enzima de amplificación seleccionada del grupo que consiste en Platino HiFi y KOD.

19. El método de la reivindicación 1, donde las perlas se seleccionan del grupo que consiste en estreptavidina-M280, neutravidina-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa y NA-agarosa.