Mejora de las vesículas de membrana externa bacteriana.

Una composición que comprende vesículas de membrana externa meningocócica,

un adyuvante de hidróxido dealuminio, un tampón de histidina y cloruro sódico, donde: (a) la concentración de VMEs es inferior a 100 μg/ml; y/o(b) la concentración de cloruro sódico es superior a 7,5 mg/ml.

Mejora de las vesículas de membrana externa bacteriana.

CAMPO TÉCNICO

Esta invención está en el campo de preparación de vesícula para fines de inmunización.

TECNICA ANTERIOR

Uno de los varios enfoques para inmunizar contra infección de N. meningitidis es el uso de vesículas de membrana externa (VMEs) . El Instituto Nacional Noruego de Salud Pública [por ejemplo, ref. 1] ha producido una vacuna eficaz de VME contra serogrupo B pero, aunque esta vacuna es segura y previene la enfermedad MenB, su eficacia se limita a la cepa usada para hacer la vacuna.

La vacuna “RIVM” se basa en vesículas que contienen seis serotipos PorA diferentes y ha demostrado ser inmunogénica en niños en ensayos clínicos en la fase II [2].

La Referencia 3 desvela una vacuna contra diferentes serotipos patogénicos del meningococo serogrupo B basada en VMEs que retienen un complejo proteico de 65 kDa. La Referencia 4 desvela una vacuna que comprende VMEs de cepas de meningococo creadas genéticamente, con las VMEs que comprenden: al menos una proteína de membrana externa (PME) de Clase 1 pero que no comprende PME de Clase 2/3. La Referencia 5 desvela VMEs que comprenden PMEs que tienen mutaciones en sus bucles superficiales y VMEs que comprenden derivados de lipopolisacárido meningocócico (LPS) .

La Referencia 6 desvela composiciones que comprenden VMEs complementadas con proteínas de enlace de transferina (por ejemplo, TbpA y TbpB) y/o Cu, Zn-superóxido dismutasa. La Referencia 7 desvela composiciones que comprenden VMEs complementadas con varias proteínas. La Referencia 8 desvela preparaciones de vesículas de membrana obtenidas de N. meningitidis con un gen fur modificado.

Así como N. meningitidis del serogrupo B, las vesículas se han preparado para otras bacterias. La Referencia 9 desvela un proceso para preparar vacunas basadas en VME para meningococo del serogrupo A. Las referencias 10 y 11 desvelan vesículas de N. gonorrhoeae. La referencia 12 desvela preparaciones de vesícula a partir de N. lactamica. Las vesículas también se ha preparado de Moraxella catarrhalis [13, 14], Shigella flexneri [15, 16], Pseudomonas aeruginosa [15, 16], Porphyromonas gingivalis [17], Treponema pallidum [18], Haemophilus influenzae [19 y 20] y Helicobacter pylori [21].

Un inconveniente de las preparaciones de vesícula bacteriana es que los antígenos protectores importantes no están presentes. Para retener antígenos tales como NspA en preparaciones de VME, la referencia 20 muestra que la expresión de nspA debería aumentar con el gen eliminado porA y cps simultáneos. Es un objeto de la invención proporcionar más preparaciones de vesículas mejoradas, junto con procesos para su fabricación. En particular, es un objeto de la invención proporcionar vesículas que retengan importantes componentes inmunogénicos bacterianos de N. meningitidis.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición que comprende vesículas de membrana externa meningocócicas, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un tampón de histidina y cloruro sódico, donde: (a) la concentración de cloruro sódico es superior a 7, 5 mg/ml; y donde (b) la concentración de VMEs es inferior a 100 µg/ml.

La concentración de cloruro sódico es preferentemente superior a 8 mg/ml, y es más preferentemente aproximadamente 9 mg/ml.

La concentración de VMEs es preferentemente inferior a 75 µg/ml, por ejemplo aproximadamente 50 µg/ml.

El tampón de histidina tiene preferentemente entre pH 6, 3 y pH 6, 7, por ejemplo pH 6, 5.

El adyuvante puede usarse en aproximadamente 3, 3 mg/ml (expresado como concentración Al3+)

La bacteria de la que se preparan las VMEs es N. meningitidis. Dentro de N. meningitidis, puede usarse cualquiera de los serogrupos A, C, W135 e Y, pero es preferente preparar vesículas del serogrupo B. Las cepas preferentes dentro del serogrupo B son MC58, 2996, H4476 y 394/98.

Para reducir la actividad pirogénica, es preferente que la bacteria tenga bajos niveles de endotoxina (LPS) . Las bacterias mutantes adecuadas son conocidas, por ejemplo, Neisseria mutante [23]. Los procesos para preparar membranas externas agotadas de LPs de bacterias Gram negativas se desvelan en la referencia 25.

La bacteria puede ser una bacteria de tipo salvaje, o puede ser una bacteria recombinante. Las bacterias recombinantes preferentes sobreexpresan (en relación con la cepa de tipo salvaje correspondiente) inmunogenes tales como NspA, 287, 741, TbpA, TbpB, superóxido dismutasa [6], et. La bacteria puede expresar más de una proteína de membrana externa PorA de Clase I, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6 o subtipos de PorA: P1.7, 16; P1.5, 2; P1.19, 15; P1.5c, 10; P1.12, 13; y P1.7h, 4 (por ejemplo, refs. 26, 27].

Las vesículas Las VMEs se preparan a partir de la membrana externa de bacterias cultivadas. Pueden obtenerse de bacterias cultivadas en medio de cultivo en caldo o sólido, preferentemente separando las células bacterianas del medio de cultivo (por ejemplo, mediante filtración o mediante centrifugación a baja velocidad para formar bolitas de las células) , lisando las células (sin detergente) , y separando una fracción de membrana externa de moléculas citoplasmáticas (por ejemplo, mediante filtración, mediante precipitación diferencial o agregación de membranas externas y/o VMEs, mediante métodos de separación por afinidad usando ligandos que específicamente reconocen moléculas de membrana externa, o mediante centrifugación a alta velocidad que forma bolitas de membranas externas y/o VMEs) .

Las VMEs pueden distinguirse de microvesículas (MVs [28] y “VMEs nativas“ (“VMENs” [66], que son vesículas de membrana que ocurren de manera natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y que se liberan en el medio de cultivo. Las MVs pueden obtenerse cultivando Neisseria en medio de cultivo de caldo, separando las células enteras del medio de cultivo de caldo (por ejemplo, mediante filtración o mediante centrifugación a baja velocidad para formar bolitas solamente de las células y no de las bulas más pequeñas) , y después recogiendo las MVs que están presentes en el medio agotado de células (por ejemplo, mediante filtración, mediante precipitación diferencial o agregación de MVs, mediante centrifugación a alta velocidad que forma bolitas de MVs) . Las cepas para uso en la producción de MVs pueden seleccionarse generalmente en base a la cantidad de MVs producidas en cultivo. Las referencias 29 y 30 describen Neisseria con alta producción de MV.

Composiciones farmacéuticas inmunogénicas Para administración a un paciente, las vesículas se formulan como composiciones inmunogénicas, y más preferentemente como composiciones adecuadas para su uso como una vacuna en humanos (por ejemplo, niños o adultos) . Las vacunas de la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección) , pero típicamente serán profilácticas.

La composición de la invención es preferentemente estéril.

La composición de la invención está preferentemente libre de pirógenos.

La composición de la invención tiene generalmente un pH de entre 6, 0 y 7, 0, más preferentemente de entre 6, 3 y 6, 9, por ejemplo 6, 6±0, 2. La composición está preferentemente amortiguada en este pH.

Otros componentes adecuados para la administración humana se desvelan en la referencia 44.

La composición comprende un adyuvante. El adyuvante es hidróxido de aluminio (incluyendo oxihidróxidos) .

Las vesículas en la composición de la invención estarán presentes en “cantidades inmunológicamente efectivas”, es decir, la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una única dosis o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención de la enfermedad. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.) , la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor que lo está tratando de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad corresponda a un rango relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios. El tratamiento de la dosis puede ser un programa de una única dosis o un programa con múltiples dosis (por ejemplo, incluyendo la dosis de revacunación) . La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunoreguladores.... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende vesículas de membrana externa meningocócica, un adyuvante de hidróxido de aluminio, un tampón de histidina y cloruro sódico, donde: (a) la concentración de VMEs es inferior a 100 µg/ml; y/o (b) la concentración de cloruro sódico es superior a 7, 5 mg/ml.

2. La composición de la reivindicación 1 donde la concentración de cloruro sódico es superior a 8 mg/ml.

3. La composición de la reivindicación 2 donde la concentración de cloruro sódico es 9 mg/ml.

4. La composición de cualquier reivindicación precedente donde la concentración de VMEs es inferior a 75 µg/ml.

5. La composición de la reivindicación 4 donde la concentración de VMEs es 50 µg/ml.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el tampón de histidina tiene entre pH 6, 3 y pH 6, 7.

7. La composición de la reivindicación 6 donde el tampón de histidina tiene pH 6, 5.

8. La composición de cualquier reivindicación precedente donde el adyuvante está presente en 3, 3 mg/ml (expresado como concentración Al3+)

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso como un medicamento.

10. El uso de una vesícula de membrana externa meningocócica en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune en un paciente, donde el medicamento también comprende un adyuvante de hidróxido de aluminio, un tampón de histidina y cloruro sódico, y donde: (a) la concentración de VMEs es inferior a 100 µg/ml; y/o

(b) la concentración de cloruro sódico es superior a 7, 5 mg/ml.