Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células.

Un procedimiento para cultivar un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie quecomprende:

proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración del0,05% (p/v) al 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0,05% (p/v) al 0,3%(p/v); y

propagar las células en el medio para formar el cultivo celular confluyente, y pasar y subcultivar las células mientrasestán en contacto con una proteasa no derivada de animales.

Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente desvelación se refiere a un medio de cultivo celular exento de proteínas animales quecomprende una combinación de un hidrolizado de soja y un hidrolizado de levadura. La invención se refiere a procesos de cultivo exentos de proteínas animales, en los que las células pueden ser cultivadas, propagadas y pasadas sin proteínas animales. Estos procesos son útiles para cultivar células, tales como células recombinantes océlulas infectadas con un virus, y para producir productos biológicos mediante procesos de cultivo celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para el cultivo de células, particularmente de células eucariotas, y más específicamente células de mamífero, existe una necesidad constante de usar medios de cultivo especiales que hacen disponibles lassustancias nutrientes y las sustancias nutrientes de crecimiento que son necesarias para un crecimiento eficaz delas células y para la producción de las proteínas o de los virus que se desean. Las formulaciones de medios decultivos celulares se han complementado con diversos aditivos, que incluyen componentes indefinidos tales como suero bovino fetal (fetal calf serum, FCS) , diversas proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino.

En general, el suero o las sustancias derivadas del suero, tales como la albúmina, la transferrina o lainsulina, pueden contener agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos y los productos biológicosobtenidos a partir de los mismos. Adicionalmente, los aditivos derivados de suero humano deben ser ensayadospara comprobar todos los virus conocidos, incluyendo hepatitis y VIH, que pueden ser transmitidos por el suero. Además, el suero bovino y los productos derivados del mismo, por ejemplo, la tripsina, son portadores de un riesgode contaminación por BSE. Además, todos los productos derivados de suero pueden estar contaminados poragentes desconocidos. En el caso del suero o de aditivos proteicos que derivan de seres humanos o de otrasfuentes animales en cultivos celulares, existen numerosos problemas (por ejemplo, la calidad y la composiciónvariables de los diferentes lotes y el riesgo de contaminación por agentes de micoplasma, virus o BSE) , particularmente si las células se usan para la producción de agentes medicinales o de vacunas para su administración a seres humanos.

Por lo tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar sistemas hospedadores y condiciones decultivo eficaces que no requieran suero ni otros compuestos proteicos animales. El medio simple exento de sueroincluye típicamente medio basal, vitaminas, aminoácidos o sales orgánicas e inorgánicas, y quizás componentes adicionales para hacer el medio nutricionalmente complejo. Sin embargo, tales medios son a menudo insuficientesnutricionalmente y deben complementarse con complementos proteicos derivados de animales o versiones recombinantes de proteínas usadas en los cultivos celulares, tales como insulina, factor de crecimiento insulinoide uotros factores de crecimiento.

Para evitar el uso de complementos proteicos derivados de animales en medios de cultivo celulares exentos de suero, se han realizado muchos intentos para proporcionar medios de cultivo celulares que estén completamenteexentos de proteínas.

Cinatl y col., Cell Biology International 17: 885-895 (1993) desvelan el desarrollo de un medio (PFK-1) específico para la propagación continua de células VERO en una superficie de cultivo de polivinilo formal (PVF) .

El documento WO96/15231 desvela un medio exento de suero formado por un medio sintético mínimo esencial y extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y procesos de producción de virus.

En el documento WO98/15614 se desvela una formulación de medio compuesta por medio de un cultivocelular basal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura o un digerido enzimático de los mismos, y/o un lípido vegetal para el crecimiento de células animales.

En el documento WO01/23527 se desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja purificado para el cultivo de células recombinantes.

En el documento WO00/03000 se desvela un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínas animales, tales como factoresde crecimiento.

Para una producción eficaz de los productos biológicos, tales como virus o proteínas recombinantes, es importante que se alcance una densidad celular óptima para obtener el máximo rendimiento del producto.

Por lo tanto, existe una necesidad actual de aumentar el crecimiento, la actividad metabólica y la densidad de las células, y de proporcionar un medio de cultivo celular óptimo desprovisto de proteínas animales para laproducción de productos biológicos, tales como aquellos usados como medicinas o vacunas en seres humanos.Además, el procesamiento anterógrado, por ejemplo, la purificación del producto deseado a partir del medio de cultivo puede ser más eficaz en coste y tiempo si no hay proteínas animales presentes en el suero. Adicionalmente, las proteínas animales inmunógenas indeseadas pueden inducir reacciones inmunológicas perjudiciales, que seevitan con la práctica de la presente invención.

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BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se establece en las reivindicaciones.

Es un objeto de la presente descripción proporcionar un medio de cultivo celular exento de proteínasanimales. Para conseguir este y otros objetos, se proporciona un medio de cultivo celular exento de proteínasanimales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura. El hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de al menos el 0, 05% (p/v) y el hidrolizado de levadura está presente en una concentración deal menos 0, 05% (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menosdel 1, 0% (p/v) y el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de menos del 0, 3% (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el0, 2% (p/v) hasta aproximadamente el 0, 6% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0, 05% (p/v) hasta aproximadamente el 0, 2% (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puede estar presente en una concentración de entre aproximadamente el 0, 25% (p/v) hastaaproximadamente el 0, 35% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de entreaproximadamente el 0, 05% hasta aproximadamente el 0, 15% (p/v) . Opcionalmente, el hidrolizado de soja puedeestar presente en una concentración de aproximadamente el 0, 3% (p/v) y el hidrolizado de levadura puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 0, 1% (p/v) . Opcionalmente, el medio comprende 3 partes enpeso de hidrolizado de soja por 1 parte en peso de hidrolizado de levadura. El hidrolizado de levadura puede ser unhidrolizado de levadura ultrafiltrado purificado, en el que al menos el 40% de dicho hidrolizado de levadura tiene unpeso molecular menor o igual a 500 Dalton. De forma similar, el hidrolizado de soja puede ser un hidrolizado de sojaultrafiltrado purificado, en el que al menos el 40% de dicho hidrolizado de soja tiene un peso molecular menor o igual a 500 Dalton.

La invención también proporciona procedimientos para cultivar cultivos confluyentes de células dependientes de la superficie que comprende proporcionar un medio que comprende hidrolizado de soja a una concentración del 0, 05% (p/v) hasta el 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0, 05% (p/v) hastael 0, 3% (p/v) ; y propagar las células en el medio para formar el cultivo confluyente y pasar y subcultivar las células mientras están en contacto con una proteasa no derivada de animales. También pueden emplearse según lainvención otras concentraciones de hidrolizados, como se ejemplificó anteriormente, . Las células pueden ser célulasanimales, tales como células de insecto, células de ave, células de mamífero, células madre, y preferiblemente aquellas células que se usan para la producción de virus in vitro. Las células también pueden ser células recombinantes. Algunos ejemplos de células incluyen aquellas elegidas del grupo de células formado por células BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células CHO, células... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para cultivar un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie quecomprende:

proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja a una concentración del0, 05% (p/v) al 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0, 05% (p/v) al 0, 3% (p/v) ; y

propagar las células en el medio para formar el cultivo celular confluyente, y pasar y subcultivar las células mientrasestán en contacto con una proteasa no derivada de animales.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son células animales elegidas del grupo formado por células de insecto, células de ave y células de mamífero.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son células recombinantes.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células se eligen del grupo de células formado porcélulas BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células COS-, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células TCMK-1, células LLC-PK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK21, células CHO, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK y células RK.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que las células son infectadas con un virus.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el virus se elige del grupo de ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus, coronavirus y adenovirus.

7. El procedimiento de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicho virus se elige del grupo del virus de la gripe, virus de vaccinia y de la viruela, virus de la viruela aviar, virus de la viruela vacuna, virus de la encefalitistransmitida por garrapatas (tick-borne encephalitis, TBE) , poliovirus, virus de la hepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitisjaponesa, virus de la rubéola, virus de la hepatitis C (HCV) , virus de la parotiditis, virus del sarampión, virusrespiratorio sincitial (respirator y syncytial virus, RSV) , virus del herpes simple (herpes simplex virus, HSV) , citomegalovirus (CMV) , virus de Epstein-Barr (EBV) , rotavirus y virus de la glosopeda (foot and mouth disease virus, FMDV) .

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dichas células son célulasVERO y dicho virus se eligen del grupo del virus de la gripe, virus de la TBE, virus de vaccinia, poliovirus, virus de lahepatitis A, virus de Ross River, virus de la fiebre amarilla y un virus quimérico derivado del mismo, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis japonesa, virus de la rubéola, , HCV, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virusrespiratorio sincitial, HSV, CMV, EBV y rotavirus.

9. Un proceso de cultivo de células confluyentes exento de proteínas animales, que comprende:

proporcionar un medio exento de proteínas animales que comprende hidrolizado de soja e hidrolizado de levadura;

hacer crecer células dependientes de superficie en el medio, y

pasar y subcultivar las células crecidas en el medio mientras están en contacto con una proteasa no derivada deanimales con objeto de obtener un cultivo celular confluyente.

10. El uso de un medio exento de proteínas animales en el cultivo de un cultivo celular confluyente de células dependientes de superficie, comprendiendo el medio hidrolizado de soja a una concentración del 0, 05% (p/v) al 1% (p/v) e hidrolizado de levadura a una concentración del 0, 05% (p/v) al 0, 3% (p/v) .

11. El procedimiento, proceso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que lascélulas se hacen crecer sobre un portador.

12. El procedimiento, proceso o uso según la reivindicación 11, en los que el portador es un portador sintético oun microportador recubierto con un material no animal.

13. El procedimiento, proceso o uso según la reivindicación 12, en los que el portador se basa en dextrano, colágeno, plástico, gelatina o celulosa.

14. El procedimiento, proceso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en los que laproteasa es una fracción de tipo tripsina purificada de Streptomyces griseus (SGT) .