Línea celular, sistema y procedimiento para el control óptico de mensajeros secundarios.

Un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula,

comprendiendo elprocedimiento:

modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a laluz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; y

expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario enrespuesta a la luz;

expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; yvisualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.

Línea celular, sistema y procedimiento para el control óptico de mensajeros secundarios.

Material presentado electrónicamente [0001] Una lista de secuencias nucleotídicas/aminoacídicas legible por ordenador presentada conjuntamente con la presente invención.

Campo de la Invención [0002] La presente invención se refiere generalmente a sistemas y enfoques para generar mensajeros secundarios en respuesta al estimulo óptico y, más particularmente, a líneas celulares, secuencias nucleotídicas, proteínas quiméricas y usos de las mismas, cada una relacionada con la producción de mensajeros secundarios en respuesta a la luz.

Antecedentes [0003] Se cree que las proteínas de unión a nucleótidos de guanina (proteínas G) alternan entre un estado de difosfato de guanosina (GDP) inactivo y un estado unido a trifosfato de guanosina (GTP) activo. Estos dos estados se han vinculado a la liberación de un mensajero secundario dentro de una célula. El mensajero secundario liberado puede funcionar para regular los procesos celulares corriente abajo.

Los mensajeros secundarios incluyen moléculas de señalización que se generan/liberan rápidamente. Estas moléculas producen respuestas celulares al activar las proteínas efectoras dentro de la célula. Los sistemas de señalización celulares ejemplares incluyen el sistema de fosfoinositol, el sistema de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y el sistema de ácido araquidónico.

Los cambios entre los diferentes estados de las proteínas G se pueden desencadenar como un resultado de proteínas denominadas receptores acoplados a proteína G (GPCR) , receptores unidos a proteína G (GPLR) , receptores de siete dominios de transmembrana (receptores 7TM) o receptores heptahelicoidales. Esta familia de proteínas incluye una diversidad de receptores transmembrana. Estos receptores responden a los estímulos externos (por ejemplo, luz, neurotransmisores, olores u hormonas) activando las rutas de transducción de señal internas a la célula. Específicamente, los ligandos unen y activan las rutas de transducción causando en consecuencia que las proteínas G alternen los estados. La actividad relacionada con GPCR se asocia con muchas enfermedades y, de esta manera, los GPCR son el objetivo de muchos productos farmacéuticos y tratamientos.

Se cree que más del 30% de todos los fármacos en el mercado se dirigen a los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y que muchos de esos fármacos se relacionan con la producción o inhibición del mensajero secundario cAMP. Existe una abundancia de procesos patológicos que implican directamente el cAMP, incluyendo enfermedades neurofisiológicas, endocrinológicas, cardiacas, metabólicas e inmunes. En el estudio de comportamientos de mamífero complejos, las limitaciones tecnológicas han impedido un control espaciotemporalmente preciso sobre los procesos de señalización intracelular. Los procedimientos basados en productos químicos actuales para modular los niveles de mensajeros secundarios, tales como niveles de cAMP, operan relativamente de manera lenta y presentan problemas para estudiar la actividad en las escalas de tiempo rápido que el cuerpo usa en conexión con cierto tejido, tal como en el tejido nervioso cardiaco. Estos procedimientos químicos carecen frecuentemente de la velocidad para sondear estas escalas de tiempo rápido (por ejemplo, mientras que se clasifican para productos terapéuticos novedosos) .

Kim y col., Biochemistr y 2005, Vol. 44, 2284-2292 describen la activación accionada por luz de señalización del receptor adrenérgico 12 mediante una rodopsina quimérica que contiene los bucles citoplásmaticos del receptor adrenérgico 12. Ahmad y col., FASEB Journal 2007, Vol. 21, 449-455 describen quimeras de Drosophila y proteínas de rodopsina bovina.

Resumen de la Invención [0008] La presente invención se dirige a superar los retos que se han mencionado anteriormente y otros relacionados con la generación de mensajeros secundarios y dispositivos de formación de imágenes relacionados y sus implementaciones. La presente invención se ilustra en varias implementaciones y aplicaciones, algunas de las cuales se resumen a continuación.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula, comprendiendo el procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; y visualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes. La invención se define adicionalmente por las reivindicaciones adjuntas. Como se describe en este documento, se pone en práctica un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula.

Una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (por ejemplo, rodopsina) se modifica con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa 1, Beta2) }. La proteína de membrana sensible a la luz se expresa en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz.

Como se describe en el presente documento, se implementa un procedimiento para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento putativo (por ejemplo, un fármaco o estimulo eléctrico o cualquiera que funcione a través de estos mensajeros secundarios) en relación con mensajeros intracelulares. Una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (rodopsina) se modifica con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2) }. La proteína de membrana sensible a la luz se expresa en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz. La proteína se expone a la luz. Se evalúan los efectos del tratamiento.

Como se describe en este documento, se desvela una célula que expresa una proteína de membrana sensible a luz quimérica (rodopsina) con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2) }.

Como se describe en este documento, se desvela una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana sensible a la luz quimérica (rodopsina) con una o más subunidades de receptor heterólogas {por ejemplo, un receptor adrenérgico (alfa1, Beta2) }.

El resumen anterior de la presente invención no pretende describir cada realización ilustrada o cada implementación de la presente invención. Las figuras y la descripción detallada que se indican a continuación ejemplifican más particularmente estas realizaciones.

Breve Descripción de los Dibujos [0015] La invención se puede entender más completamente en consideración de la descripción detallada de diversas realizaciones de la invención que se indican a continuación junto con los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1A muestra una representación esquemática que muestra optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 1B muestra el Ensayo Inmunoabsorbente Ligando a Enzimas (ELISA) de cAMP, cGMP e IP1 de células transfectadas con ya sea nada, optoGs u optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 1C muestra la formación de imágenes de Ca de células transfectadas con proteínas de fusión mCherr y de optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 2 la formación de imágenes de Ca de células transfectadas con las proteínas de fusión mCherr y de optoGs y optoGq, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 3A muestra los niveles de cAMP, IP1 e IP3 para las células HEK que expresan diversas construcciones, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 3B muestra un vector de expresión lentiviral, inmunotinción GAD de células que expresan opto-atAR y la activación pCREB observada en células que expresan optoXR (mCherr y +) después de 10 min de estimulación óptica, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4A muestra el objetivo de optrodo de accumbens traducidos, formas de onda pico y velocidad de disparo de línea basal para construcciones indicadas, consistentes con las realizaciones ejemplares de la presente invención;

la figura 4B muestra registros de optrodos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para generar mensajeros secundarios en una célula, comprendiendo el

procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas; y

expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar en la célula un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al mensajero secundario; y visualizar la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la una o más subunidades de receptor heterólogas incluyen un receptor adrenérgico.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica es una proteína de siete transmembranas.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el mensajero secundario es uno de cAMP, monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) , trifosfato de inositol/1, 4, 5-trisfosfato de inositol/trifosfoinositol (IP3) y ácido araquidónico.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de expresión se realiza in vivo.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de expresión se realiza in vitro.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, que incluye adicionalmente la etapa de estimular ópticamente la proteína de membrana sensible a la luz expresada.

8. Un procedimiento para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento putativo relacionado con

mensajeros intracelulares, comprendiendo el procedimiento: modificar una secuencia nucleotídica para expresar una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas;

expresar la proteína de membrana sensible a la luz en una célula para producir un mensajero secundario en respuesta a la luz; expresar un canal catiónico dirigido al mensajero secundario en la célula que es sensible al mensajero secundario; exponer la proteína sensible a la luz a la luz; y evaluar los efectos del tratamiento visualizando la actividad resultante usando tintes sensibles a cationes.

9. Una célula adecuada para su uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7,

expresando la célula: a) una proteína de membrana basada en rodopsina sensible a la luz quimérica con una o más subunidades de receptor heterólogas, en la que la proteína quimérica produce un segundo mensajero;

y b) un canal catiónico dirigido al mensajero secundario que es sensible al segundo mensajero.

10. La célula de la reivindicación 9, en la que la una o más subunidades de receptor heterólogas se selecciona entre un receptor adrenérgico alfa1 y un receptor adrenérgico beta-2.

11. Un polinucleótido adecuado para su uso en un procedimiento de uno cualquiera de las reivindicaciones 1-7, comprendiendo el polinucleótido una secuencia nucleotídica para expresar una proteína basada en rodopsina de membrana sensible a la luz quimérica con una o más de las subunidades de receptor heterólogas del receptor adrenérgico alfa1, en el que la secuencia nucleotídica codifica una secuencia aminoacídica que tiene una homología de la secuencia aminoacídica de al menos el 90% con respecto a la secuencia aminoacídica de acuerdo con la SEQ ID. NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la secuencia nucleotídica está unida operativamente a un promotor específico del tipo celular.

13. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la secuencia nucleotídica es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

14. Una célula adecuada para su uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, expresando la célula un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una homología de la secuencia aminoacídica de al menos el 90% con respecto a la secuencia aminoacídica de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

15. La célula de la reivindicación 14, en la que la secuencia aminoacídica es la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID

NO: 4. 15