Isomerasa de arabinosa expresada en el género Corynebacterium y procedimiento de elaboración de tagatosa mediante su uso.

Un procedimiento para producir una isomerasa de arabinosa que comprende:

preparar un vector recombinante mediante la inserción de un gen que codifica para una isomerasa de arabinosatermófila, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3 procedente de la Thermotoga neapolitanaDSM 5068, en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611 o pCJ-7 KCCM 10617;

transfectar una cepa del género Corynebacterium con el vector recombinante, y

producir la isomerasa de arabinosa mediante el cultivo de la cepa del género Corynebacterium.

Isomerasa de arabinosa expresada en el género Cor y nebacterium y procedimiento de elaboración de tagatosa mediante su uso 5

Campo técnico La presente invención se refiere a un gen de la isomerasa de arabinosa expresado en una cepa del género Cor y nebacterium y a un procedimiento para la preparación de tagatosa mediante su uso, y más particularmente, la presente invención proporciona un gen que codifica para la isomerasa de arabinosa, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3, procedente de Thermotoga neapolitana DSM 5068, un vector de expresión recombinante preparado mediante la inserción del gen en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611P o pCJ-7 KCCM 10617P, un procedimiento de preparación de una isomerasa de arabinosa termófila mediante la expresión del gen en una cepa del género Cor y nebacterium de calidad alimentaria GRAS transfectada con el vector de expresión recombinante, y un procedimiento de preparación de tagatosa a partir de galactosa usando el mismo.

Antecedentes de la técnica Con el creciente interés en el bienestar o en una vida saludable, se ha propuesto la tagatosa como una alternativa al azúcar ya que tiene menos efectos secundarios y el azúcar es uno de los principales factores que provocan diversas enfermedades en adultos. La tagatosa es el isómero de la galactosa y es conocido por tener unas propiedades fisicoquímicas similares a las de la fructosa. La tagatosa es un azúcar natural bajo en calorías, y recientemente ha sido aprobado por la FDA de EE.UU. como una sustancia GRAS (Generally Recognized As Safe [generalmente reconocida como segura]) , por lo que ahora está permitida su adición como edulcorante en comidas, bebidas,

comidas saludables, aditivos de dietas, etc.

GRAS indica una sustancia que es generalmente reconocida como segura, lo que es juzgado por personas especializadas con una experiencia y una capacidad suficientes mediante procedimientos científicos y el examen en las condiciones indicadas y el propósito de uso. GRAS es un sistema único usado únicamente en los EE.UU. para evaluar la seguridad de los alimentos y de las sustancias químicas alimentarias (en ciertas condiciones) pero es reconocido mundialmente.

La tagatosa se produce bien mediante isomerización, que es un procedimiento químico que usa un catalizador para producir un isómero de galactosa, o bien mediante un procedimiento biológico que usa la isomerasa para convertir

enzimáticamente la galactosa.

Uno de los procedimientos biológicos bien conocidos por los expertos en la técnica es convertir aldosa o derivados de aldosa en cetosa o derivados de cetosa mediante el uso de una enzima. La isomerización de galactosa en tagatosa mediante el uso de la isomerasa de arabinosa se lleva a cabo generalmente termodinámicamente y a una elevada temperatura, y muestra una tasa de conversión proporcionalmente alta. Por lo tanto, el desarrollo de una enzima que trabaje de forma estable a elevadas temperaturas y de un procedimiento para preparar tagatosa usando la misma son técnicas clave para la aplicación industrial de la misma basada en la conversión biológica de la tagatosa usando una isomerasa. Mediante el cribado de isomerasas de arabinosa derivadas de bacterias termófilas, se ha ensayado una isomerasa termófila aplicable industrialmente, y también han realizado esfuerzos muchos 45 equipos de investigación para establecer un proceso de isomerización que usa la misma.

En Corea, se ha desarrollado un procedimiento de isomerización enzimática que usa una isomerasa de arabinosa por parte de Tong Yang Confectioner y Corp. Según el procedimiento, la isomerasa de arabinosa derivada de E. coli se expresó homogéneamente en E. coli mediante tecnología recombinante. Esta isomerasa recombinante se hizo reaccionar a 30 °C durante 24 horas para convertir la galactosa en tagatosa, y en ese momento la tasa de conversión era del 25 %, lo que indicaba que tanto la termoestabilidad como el rendimiento de conversión eran muy bajos (solicitud de patente coreana Nº 99-16118) . El profesor Oh, Deok-keun y sus colegas (universidad de Sejong) tuvieron éxito en la expresión heterogénea de la isomerasa de arabinosa procedente de Geobacillus stearothermophilus en E. coli y basándose en eso propusieron un procedimiento de isomerización a elevada 55 temperatura para convertir la galactosa en tagatosa. Los presentes inventores tuvieron éxito en la clonación de un nuevo gen de isomerasa de arabinosa de Thermotoga neapolitana y en su producción en E. coli, y desarrollaron adicionalmente un procedimiento de elaboración de tagatosa en un estado hipertermófilo usando la enzima (patente coreana Nº 10-0443865) .

El documento WO02/052021 se refiere a un gen que codifica la L-isomerasa de arabinosa derivada de Thermatoga neapolitana 5068, a una isomerasa de arabinosa termoestable expresada por dicho gen, a un proceso para preparar dicha isomerasa de arabinosa y a un proceso para preparar D-tagatosa empleando dicha isomerasa de arabinosa.

La producción de tagatosa usando una isomerasa de arabinosa derivada de termófilos aún depende del 65 procedimiento de usar una enzima recombinante expresada en masa en E. coli recombinante o de la isomerización de galactosa en tagatosa usando un hospedador que contiene la enzima recombinante. Sin embargo, esta producción biológica de tagatosa usando E. coli recombinante no es apropiada para la producción de tagatosa como ingrediente alimentario. Para producir tagatosa como aditivo alimentario, es esencial que la isomerasa de arabinosa sea expresada en un hospedador que sea un microorganismo GRAS apropiado para la producción en masa de la misma.

Cor y nebacterium es un microorganismo industrial que se ha usado para la producción de compuestos químicos aplicables a varios ámbitos incluyendo L-lisina, L-treonina y varios alimentos que contienen ácidos nucleicos, suministros médicos y alimentos. La cepa Cor y nebacterium es una cepa GRAS (generalmente reconocida como segura) , que favorece la manipulación génica y la producción en masa. Además, esta cepa es muy estable en las diversas condiciones del proceso y tiene una membrana celular comparativamente estable, en comparación con otras bacterias. Por lo tanto, esta cepa permanece estable incluso bajo la elevada presión osmótica generada por una elevada concentración de galactosa.

Srivastava P y Deb JK revisan sistemas de expresión génica en corinebacterias, incluyendo plásmidos corinebacterianos y elementos reguladores, y el desarrollo de vectores para la clonación y la expresión génica (Srivastava P y Deb JK (2005) Gene expression systems in cor y nebacteria. Protein Expression and Purification 40: 221 -229) .

Los presentes inventores averiguaron que la isomerasa de arabinosa termófila procedente de la Thermotoga neapolitana hipertermófila es sobreexpresada en una forma activa en una cepa del género GRAS de Cor y nebacterium, y adicionalmente completaron la invención según las reivindicaciones 1 -3 mediante el desarrollo de una nueva técnica para inducir la isomerización de la tagatosa a partir de una elevada concentración de galactosa mediante el uso de enzimas recombinantes expresadas en especies de Cor y nebacterium.

Desvelación de la invención

Problema técnico Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar cepas GRAS que expresan la isomerasa de arabinosa de forma estable en sus células en las condiciones de elevada temperatura y elevada concentración de galactosa aprovechando la producción en masa de la enzima recombinante en la cepa del género Cor y nebacterium.

Solución técnica Para superar los límites del procedimiento convencional, en el que una enzima sólo podría ser expresada en E. coli, es también un objeto de la presente solicitud proporcionar un procedimiento para preparar tagatosa en el que se expresa la isomerasa de arabinosa procedente de Thermotoga en una forma activa en una cepa GRAS de Cor y nebacterium, y consecuentemente se genera tagatosa de calidad alimentaria a partir de galactosa usando la enzima recombinante expresada u hospedadores que la contienen.

El anterior objeto y otros objetos de la presente solicitud pueden conseguirse mediante las siguientes formas de realización de la presente invención.

En lo sucesivo se describe la presente invención con detalle.

La presente invención proporciona un procedimiento según la reivindicación 1 para producir una enzima recombinante mediante la introducción del gen de la isomerasa de arabinosa a partir de un microorganismo que es muy difícil de obtener a partir de un cultivo celular directo, porque las condiciones de crecimiento óptimas para el microorganismo son al menos 80 °C o son... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una isomerasa de arabinosa que comprende:

preparar un vector recombinante mediante la inserción de un gen que codifica para una isomerasa de arabinosa termófila, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº: 3 procedente de la Thermotoga neapolitana DSM 5068, en el vector lanzadera pCJ-1 KCCM 10611 o pCJ-7 KCCM 10617;

transfectar una cepa del género Cor y nebacterium con el vector recombinante, y 10 producir la isomerasa de arabinosa mediante el cultivo de la cepa del género Cor y nebacterium.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa es Cor y nebacterium glutamicum CJ-1-

TNAI KCCM 10786P. 15

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa es Cor y nebacterium glutamicum CJ-7-TNAI KCCM 10787P.