Isoformas de esterasa de hígado de cerdo.

Esterasas según las SEC ID No. 6, 8 ó 10.

Isoformas de esterasa de hígado de cerdo La presente invención se refiere a las isoformas de esterasa de hígado de cerdo (!PLE) citadas en las reivindicaciones, a vehículos que la contienen y a su aplicación en la preparación de alcoholes o ésteres enantioméricamente enriquecidos.

Las lipasas y esterasas son adecuadas como biocatalizadores eficaces para la preparación de una pluralidad de compuestos ópticamente activos. Sin embargo, aunque comercialmente puede obtenerse una serie completa de lipasas especialmente de origen microbiano -, solo muy pocas esterasas están disponibles en cantidades industriales para su utilización en una resolución de racematos [Bornscheuer, U.T. y Kazlauskas R.J., Hydrolases in Organic Synthesis (2005) , 2ª ed, Wiley-VCH, Weinheim].

A este respecto, se presta especial interés a la esterasa de hígado de cerdo debido a sus interesantes propiedades catalíticas en la síntesis orgánica [Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistr y (2004) , 5ª ed. Springer, Berlín; Jones, J.B. Pure Appl. Chem, (1990) , 62, 1445-1448, Jones y col., Can. J. Chem. (1985) , 63, 452-456; Lam, L.K.P. y col.,

J. Org. Chem. (1986) , 51, 2047-2050) .

Aunque pudo mostrarse que con extractos de esterasa de tejido de hígado de cerdo pueden convertirse parcialmente sustratos con buena estereoselectividad, el uso de aquellos extractos está, no obstante, asociado a una serie de desventajas. Además de las fluctuaciones de la proporción de esterasas entre distintos lotes, la presencia de otras hidrolasas se considera especialmente problemática en lo que se refiere a la estereoselectividad (Seebach, D. y col., 25 Chimia (1986) , 40, 315-318) . Adicionalmente, existe el problema de que los extractos convencionales están presentes en forma de varias isoenzimas (Farb, D. y col., Arch. Biochem. Biophys. (1980) 203, 214-226) , que difieren significativamente en su especificidad por sustrato. Heymann, E. y Junge, W. (Eur. J. Biochem. (1979) , 95, 509-518; Eur. J. Biochem. (1979) , 95, 519-525) realizaron una costosa separación electroforética, de manera que pudieron aislar fracciones que escinden preferiblemente butirilcolina, prolin-β-naftilamida y butirato de metilo. A diferencia de esto, otras investigaciones muestran (por ejemplo, Lam, L.K.P. y col, J. Am. Chem. Soc. (1988) 110, 4409-4411) solamente diferencias en la actividad, pero no en la especificidad de fracciones individuales.

Aunque la clonación de genes putativos de esterasa de hígado de cerdo ya se conoce desde hace tiempo (Takahashi, T y col., J. Biol. Chem. (1989) , 264, 11565-11571; FEBS Lett. (1991) , 280, 297-300; FEBS Lett. (1991) , 293, 37-41; David, L. y col., Eur, J. Biochem. (1998) 257, 142-148) , la expresión recombinante funcional de una esterasa de hígado de cerdo activa solo se ha descrito hasta la fecha en Pichia pastoris (Lange, S. y col., ChemBioChem (2001) , 2, 576-582) o E. coli (documento DE 10061864) .

En la bibliografía también se han descrito aditivos para el medio durante la expresión en E. coli. La adición de etanol hasta el 3% (v/v) al medio induce la formación de chaperonas endógenas de E. coli, enzimas que sirven de ayuda en el plegamiento y generalmente respaldan el correcto plegamiento (Thomas, JG, Protein Expression and Purif (1997) , 11, 289-296) . Sin embargo, la expresión de la esterasa de hígado de cerdo en Origami de E. coli con adición del 3% (v/v) de etanol al medio no condujo a expresión activa detectable de la esterasa en E. coli, sino solo a cuerpos de inclusión.

En el documento DE10061864 se propone la coexpresión de determinadas chaperonas y de !PLE. De esta manera pudo generarse por primera vez !PLE activa a partir de E. coli.

Resumiendo puede decirse que, aunque es posible la expresión de la esterasa de hígado de cerdo nativa de E. coli, sin embargo todavía no está establecida a escala industrial. Además, es útil y necesario mejorar las actividades (del sustrato) de las esterasas de hígado de cerdo para además obtener sistemas mejorados que puedan utilizarse preferiblemente a escala industrial en el marco de la preparación biosintética de productos intermedios químicos.

Por tanto, era objetivo de la presente invención la especificación de nuevas esterasas mejoradas en comparación con el estado de la técnica. Se prepararán nuevas esterasas con actividad y/o selectividad y/o estabilidad mejoradas. Estas esterasas serán superiores a las del estado de la técnica, especialmente en cuanto al rendimiento espacio/tiempo y a la enantioselectividad durante la conversión, así como a la especificidad por sustrato alterada o ampliada.

Este objetivo se alcanza según las reivindicaciones.

Proporcionando esterasas según la SEC ID No. 2 que presentan al menos una mutación, seleccionada del grupo que consisten en:

Posición Aminoácido 94 E 96 I 97 A, G 98 G 101 L 108 R 113 I 114 P 150 V 154 S 155 T 159 L 160 A 255 F 257 A 258 G 306 P 307 F 308 A 311 L 315 P 323 T 480 A 482 F 484 R

se llega sorprendentemente a especies que cumplen los objetivos mencionados. Mediante mutaciones en estos sitios puede variarse y mejorarse especialmente la especificidad por sustrato, la enantioselectividad y/o la actividad de la !PLE nativa. La posición se refiere a este respecto naturalmente al primer aminoácido de SEC ID No. 2.

Son preferidas las esterasas según las SEC ID No. 4, 6, 8 y 10. Éstas presentan en comparación con la !PLE nativa mejor actividad y/o selectividad y/o estabilidad. Las esterasas según la invención destacan especialmente en cuanto a las actividades, enantioselectividades u otras especificidades por sustrato.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una esterasa según la invención. Las secuencias de ácidos nucleicos son aquellas de SEC ID No. 3, 5, 7 y 9, o su forma complementaria.

En otra realización, la presente invención se refiere a genes, sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo,

microorganismos) o plásmidos/vectores recombinantes que presentan uno o varios de los ácidos nucleicos según la invención.

Por un sistema de expresión se entiende un sistema para la expresión recombinante de los ácidos nucleicos según la invención y, por tanto, para la preparación recombinante de los polipéptidos según la invención. Esta preparación puede realizarse preferiblemente en microorganismos transformados o transfectados u otros huéspedes con secuencias de ácidos nucleicos o vectores correspondientes (véase más adelante) (los términos “transformación” y “transfección” se 5 usan sinónimamente según esta invención) . La transformación o transfección pueden realizarse según procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante coprecipitación con fosfato de calcio, lipofección, electroporación, procedimiento con PEG/DMSO, bombardeo con partículas o infección viral/por bacteriófagos. La célula según la invención puede contener ácido nucleico recombinante en forma extracromosómica o cromosómicamente integrada. En otras palabras, la transfección/transformación puede ser una transfección/transformación estable o transitoria. El experto conoce protocolos 10 de transfección y transformación (Chan y Cohen. 1979. High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts by Plasmid DNA. Mol Gen Genet. 168 (1) :111-5; Kieser y col., 2000. Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation Norwich; Sambrook y col., 1989. Molecular Cloning. A Laborator y Manual. En: segunda ed. Cold Spring Harbor Laborator y Press. Cold Spring Harbor. NY.; Irani y Rowe. 1997. Enhancement of transformation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 by Mg2+ and heat. Biotechniques 22: 54-56; Balbas, P. y Bolivar, F. (1990) , Design and construction of 15 expression plasmid vectors in E. coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. y Denhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham) . En relación con la manera de proceder general (PCR, clonación, expresión, etc.) también se remite a la siguiente bibliografía y lo allí citado: manual de usuario del kit Universal GenomeWalker™, Clontech, 3/2000; Triglia T.; Peterson, M. G. y Kemp, D.J. (1988) , A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences, Nucleic Acids Res. 16, 8186.

Preferiblemente, el huésped es un microorganismo recombinante de origen procariota. Células huésped adecuadas incluyen células de microorganismos unicelulares como células bacterianas. Como microorganismos son de mencionar a este respecto procariotas como E. coli, Bacillus subtilis. Además, pueden utilizarse bacterias de... [Seguir leyendo]

1. Esterasas según las SEC ID No. 6, 8 ó 10.

2. Ácido nucleico aislado que codifica una esterasa según la reivindicación 1.

3. Gen, vector, plásmido y microorganismo recombinante, que presentan un ácido nucleico clonado según la 5 reivindicación 2.

4. Microorganismo recombinante según la reivindicación 3 que contiene adicionalmente al menos un gen chaperona clonado.

5. Uso de la esterasa de la reivindicación 1 para la preparación de alcoholes, ácidos carboxílicos o ésteres enantioméricamente enriquecidos.

6. Uso de ácidos nucleicos según la reivindicación 2 en un procedimiento para la preparación de un polipéptido con actividad y/o selectividad y/o estabilidad mejoradas en comparación con el polipéptido de SEC ID No. 2 preparado mediante i) mutagénesis de SEC ID No. 5, 7 ó 9,

ii) clonación de la secuencia de ácidos nucleicos obtenidos a partir de i) en un vector adecuado con posterior 15 transformación en un sistema de expresión adecuado y

iii) detección y aislamiento del correspondiente polipéptido con actividad y/o selectividad y/o estabilidad mejoradas.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Literatura no patente citada en la descripción