Hidrogeles de PEG disolubles sensibles a estímulos biofuncionalizados.

Hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos que comprende una matriz de polímeros de PEG,

que estánmodificados para contener al menos una proteína de fusión multifuncional, proteína de fusión multifuncional quecomprende como componentes un péptido de unión al sustrato (SBP), un péptido de unión a RGD repetitivo,preferentemente un marcador para la purificación y al menos un conector N- y/o C-terminal;

donde la al menos una proteína de fusión multifuncional está unida covalentemente al polímero de PEG,donde el péptido de unión al sustrato (SBP) está seleccionado de entre la secuencia N-terminal de la subunidad Bde la ADN girasa de Escherichia coli (GyrB), de la secuencia N-terminal de la subunidad B de la ADN girasa deEscherichia coli de acuerdo con SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80% deidentidad con la secuencia de acuerdo con SEC ID Nº 2, o de entre proteínas FKBP, FM, ToxT, DHFR, Cyp, E, PIP,TetR, ArgR, ArsR, HucR, FRB, estreptavidina, avidina, neutravidina, receptor de hormona esteroide, una hormonaesteroide o una proteína de unión a heparina;

donde el conector N- y/o C-terminal está seleccionado de entre un resto que contiene tiol, un aminoácido modificadocon tiol o que contiene tiol, una cisteína, una homocisteína, un tiol acoplado a maleimida, un resto de vinilsulfona,secuencias peptídicas, enlaces peptídicos, una HaloTag, una SNAP-tag, una CLIP-tag, un enlace de reacción detransglutaminasa, aminoácidos o entidades de formación de quelatos NTA o una polihistidina de unión a un iónmetálico multivalente, y donde la formación del gel se realiza uniendo el péptido de unión al sustrato (SBP) con susustrato específico.

Hidrogeles de PEG disolubles sensibles a estímulos biofuncionalizados La presente invención se dirige a un hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos biofuncionalizado. Este hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de la invención comprende una matriz de polímeros de PEG, que están modificados para contener al menos una proteína de fusión multifuncional, proteína de fusión multifuncional que comprende preferentemente como componentes un péptido de unión al sustrato (SBP) , preferentemente un péptido de unión a RGD repetitivo y/o un dominio de unión a ZZ, preferentemente un marcador para la purificación y al

menos un conector N-y/o C-terminal. La presente invención se dirige además a los hidrogeles de PEG disolubles sensibles a estímulos para su uso en el tratamiento de lesiones, en apósitos quirúrgicos, para su uso en el tratamiento de heridas, para su uso en la regeneración de tejidos duros y blandos, para su uso en el tratamiento de heridas de la cavidad oral, en el campo de la oftalmología, en el campo de los defectos periodontales, etc. Además, la presente invención proporciona un kit que comprende el hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de la invención y, opcionalmente, otros componentes.

Los sistemas biológicos tales como la piel, los tejidos conjuntivos o los huesos del sistema esquelético son sistemas complejos, teniendo lugar su regeneración y/o reparación bajo una organización controlada espacial y temporalmente. Una miríada de señales y células actúa en el espacio y el tiempo para curar una herida, por ejemplo, 20 para reemplazar una parte destruida de la piel durante la regeneración tisular, o para inducir o favorecer el crecimiento oseo, etc. En muchos de estos casos, se han de llenar las cavidades para evitar una pérdida de tejido blando y/o duro, o para evitar una reducción significativa o incluso un colapso del mismo. Sin embargo, la eficacia de muchos biomateriales usados actualmente para la construcción de vehículos o matrices adecuados para dichos tratamientos está limitada por la falta de estructuras multifuncionales que complementen la dinámica inherente de estos sistemas biológicos.

En este contexto, se sabe que múltiples impulsos físicos, químicos y biológicos actúan cooperativa y/o sinérgicamente para afectar a la función celular durante la regeneración tisular in vitro e in vivo. Por lo tanto, para diseñar biomateriales que sirvan para facilitar la regeneración tisular, se debe considerar cuidadosamente la interacción entre las células/tejidos diana y estos impulsos medioambientales. Normalmente, son factores importantes los factores de crecimiento solubles, las interacciones célula-célula y célula-material, y las propiedades mecánicas del microambiente (véase, por ejemplo, Lin y Anseth, Expert Review, "PEG hydrogels for the controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine", Pharmaceutical Research, Vol. 26, Nº 3, marzo de 2009) .

Teniendo en cuenta estos requisitos, la administración de moléculas bioactivas y la búsqueda de vehículos adecuados han sido objeto de una intensa investigación, pues son diversas las moléculas diana, incluyendo fármacos de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, péptidos, factores de crecimiento y hormonas, y proteínas, para la regeneración acelerada de los tejidos.

Un enfoque prometedor en este campo se basa en el uso de los denominados hidrogeles. Los hidrogeles representan una clase de materiales con numerosas ventajas para albergar simultáneamente células y biomoléculas. También hay numerosas posibilidades que permiten controlar estrechamente las características de liberación a través de cambios sistemáticos en la estructura física y química del gel (véase, por ejemplo C. C Lin y A.

T. Metters. “Hydrogels in controlled release formulations: Network design and mathematical modeling”. Adv. Drug

Deliv. Rev. 58:1379-1408 (2006) ) . Debido a la variabilidad de sus propiedades, los hidrogeles se han usado para permitir la preparación de los denominados polímeros "sensibles a estímulos" sintéticos, que se asemejan a las estructuras de tejidos naturales y modelos tisulares. En base a sus propiedades químicas y físicas, éstos polímeros “sensibles a estímulos" sintéticos se han acuñado con diferentes nombres, por ejemplo, polímeros “sensibles a estímulos", polímeros “sensibles al medio ambiente” o polímeros "inteligentes" (véase Brawa et al., Biomed. Mater. 4

(2009) 022001 (15 pp) ) . La característica distintiva de estos polímeros sensibles a estímulos es su capacidad para someterse a cambios rápidos en su microestructura de un estado hidrófilo a un estado hidrófobo, que se activa por pequeños cambios en el medio ambiente. Los cambios macroscópicos que se producen son reversibles, por lo tanto, el sistema es capaz de volver a su estado inicial al retirarse el desencadenante. Los estímulos comunes que conducen a estos cambios se clasifican además bien como estímulos externos o internos. Los sistemas controlados 55 externamente se basan en estímulos aplicados externamente que se producen con la ayuda de diferentes dispositivos de generación de estímulos, lo que finalmente produce la administración de fármacos por impulsos. Los sistemas regulados internamente también se conocen como dispositivos auto-regulados, donde la velocidad de liberación es controlada por un mecanismo de retroalimentación que se produce dentro del cuerpo para controlar los cambios estructurales en la red de polímero y para exponer la liberación del fármaco deseada, sin ninguna 60 intervención externa. Los estímulos de los polímeros "sensibles a estímulos" pueden ser, por ejemplo, un cambio de disolvente, pH, temperatura, corriente eléctrica, campos magnéticos o tensión mecánica. Las respuestas a estos estímulos se pueden manifestar como cambios en la forma, las características superficiales, la solubilidad y la formación de un ensamblaje molecular intrincado o una transición sol-gel (véase Brawa et al., Biomed. Mater. 4 (2009) 022001 (15pp) ) .

Los hidrogeles que se pueden usar como polímeros “sensibles a estímulos” sintéticos pueden estar basados en polímeros sintéticos tales como poli (etilenglicol) (PEG) , poli (alcohol vinílico) (PVA) , poli (N-isopropilacrilamida) (poli (NiPAAm) ) . Dichos hidrogeles se han usado en numerosas aplicaciones de medicina regenerativa (véase, por ejemplo, N. A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung y H. Ichikawa. “Hydrogels in pharmaceutical formulations”. Eur. J.

Pharm. Biopharm. 50:27-46 (2000) ) .

En este contexto, Schmaljohann et al. (Schmaljohann, D., Nitschke, M., Schulze, R., Werner, C., Eichhorn, K. J., "Patterning of stimuli-responsive hydrogels", Polymer Preprints 45, 380-381, diciembre de 2004) divulgan un hidrogel termosensible a base de un precursor de poli (NiPAAm-co-PEGMA) . Se ha demostrado que el material muestra un cambio inducido por la temperatura en el comportamiento de adhesión y desprendimiento celular. Se puede utilizar en vehículo de cultivo celular inteligente con diferente química de sustrato en una resolución lateral que refleje las dimensiones de las células (intervalo micrométrico) .

Del mismo modo, Voit et al. (Voit, B.; Schmaljohann, D.; Gramm, S., Nitschke, M., Werner, C., "Stimuli-responsive polymer layers for advanced cell culture technologies", International journal of Materials Research 98, 646-650, agosto de 2007) divulgan una serie de copolímeros de injerto que consisten en poli (N-isopropilacrilamida) como componente termosensible de la estructura del polímero y de las cadenas laterales de poli (etilenglicol) . Los hidrogeles inmovilizados en la superficie presentan una transición de parcialmente colapsados a totalmente hinchados, que está en el intervalo de 32-35 ºC y corresponde a la temperatura de solución crítica inferior de los polímeros solubles. Se encontró que los soportes revestidos de hidrogel permiten la adhesión, la difusión y la proliferación de las células, y permiten la separación dependiente de la temperatura rápida y eficaz de láminas de células intactas o múltiples tipos de células.

Sin embargo, los geles sensibles a la temperatura, aún siendo adecuados para algunas aplicaciones in vitro basadas en células, no son adecuados para la administración in vivo, ya que el estímulo de la temperatura se tiene que proporcionar en el paciente o en el lugar de la administración durante o después de la administración del hidrogel sensible a estímulos a un paciente por tratar. Se producirán problemas similares cuando se utilizan hidrogeles sensibles a estímulos cuyos estímulos se seleccionan de entre un cambio de disolvente, pH, corriente eléctrica,... [Seguir leyendo]

1. Hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos que comprende una matriz de polímeros de PEG, que están modificados para contener al menos una proteína de fusión multifuncional, proteína de fusión multifuncional que comprende como componentes un péptido de unión al sustrato (SBP) , un péptido de unión a RGD repetitivo, preferentemente un marcador para la purificación y al menos un conector N-y/o C-terminal; donde la al menos una proteína de fusión multifuncional está unida covalentemente al polímero de PEG, donde el péptido de unión al sustrato (SBP) está seleccionado de entre la secuencia N-terminal de la subunidad B de la ADN girasa de Escherichia coli (GyrB) , de la secuencia N-terminal de la subunidad B de la ADN girasa de Escherichia coli de acuerdo con SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80% de identidad con la secuencia de acuerdo con SEC ID Nº 2, o de entre proteínas FKBP, FM, ToxT, DHFR, Cyp, E, PIP, TetR, ArgR, ArsR, HucR, FRB, estreptavidina, avidina, neutravidina, receptor de hormona esteroide, una hormona esteroide o una proteína de unión a heparina; donde el conector N-y/o C-terminal está seleccionado de entre un resto que contiene tiol, un aminoácido modificado con tiol o que contiene tiol, una cisteína, una homocisteína, un tiol acoplado a maleimida, un resto de vinilsulfona, secuencias peptídicas, enlaces peptídicos, una HaloTag, una SNAP-tag, una CLIP-tag, un enlace de reacción de transglutaminasa, aminoácidos o entidades de formación de quelatos NTA o una polihistidina de unión a un ión metálico multivalente, y donde la formación del gel se realiza uniendo el péptido de unión al sustrato (SBP) con su sustrato específico.

2. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido de unión a RGD repetitivo tiene la fórmula (RGDn) , donde n es 1, 2, 3, 4 o 5, y donde la secuencia RGD está seleccionada de entre una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de SEC ID Nº 3 a 33, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% e incluso más preferentemente al menos un 97, 5% de identidad con la secuencia de acuerdo con cualquiera de SEC ID Nº 3 a 33.

3. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el polímero de PEG es un PEG estrella de múltiples brazos, preferentemente un polímero de PEG estrella de 3 a 15 brazos. 30

4. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, donde el polímero de PEG está modificado para permitir un enlace covalente (reticulación) con al menos una proteína de fusión multifuncional a través de un enlace tioéter.

5. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, donde el marcador para la purificación está seleccionado de entre un marcador His6, un marcador FLAG, un marcador HA o un marcador MYC.

6. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteína de fusión multifuncional comprende como componentes un péptido de unión al sustrato (SBP) , un péptido de unión a RGD repetitivo (RGDn) , un marcador para la purificación y al menos un resto conector N-y/o C-terminal.

7. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, donde el hidrogel de PEG está además modificado con una proteína de fusión que comprende como componentes un péptido 45 de unión al sustrato (SBP) , un dominio ZZ, un marcador para la purificación y al menos un conector N-y/o C-terminal y/o una proteína de fusión que comprende como componentes un factor de crecimiento, opcionalmente un conector, opcionalmente un dominio Fc y opcionalmente un marcador para la purificación.

8. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, donde están 50 incorporadas células en el hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos seleccionadas de entre células madre, células madre humanas, células madre adultas, células madre embrionarias, células madre diseñadas o no diseñadas mediante ingeniería genética, células madre primarias o inmortalizadas, células madre mesenquimales, osteoblastos, cementoblastos, células de fibroblastos derivadas de tejidos conjuntivos, fibroblastos gingivales, cutáneos y corneales, solos o junto con fibroblastos del ligamento periodontal, fibroblastos del ligamento periodontal,

queratinocitos, queratinocitos gingivales, queratinocitos de la cavidad oral y del tracto aerodigestivo superior, así como de la piel o de la superficie ocular, células del sistema nervioso central, células neuronales, células endoteliales de tejido vascular y corneal, pericitos, miocitos, adipocitos, astrocitos y melanocitos.

9. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, donde están 60 incorporados componentes adicionales en el hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos seleccionados de entre células, proteínas, polipéptidos, factores de crecimiento, proteasas, antibióticos, anticuerpos, polímeros antimicrobianos y antiflogísticos permitidos clínicamente no esteroides, incluyendo derivados de (i) ácido acetilsalicílico, (ii) ácido arilpropiónico, (iii) ácido arilacético, (iv) ácido indolacético, (v) ácido antranílico y Oxicams, e inhibidores selectivos de la COX-2.

10. Método para la preparación del hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar al menos una proteína de fusión multifuncional según lo definido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9; b) mezclar la al menos una proteína de fusión multifuncional de acuerdo con la etapa a) con un sustrato para la proteína de unión al sustrato (SBP) según lo definido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9; c) añadir la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa b) a un polímero de PEG según lo definido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, formando de este modo el hidrogel de PEG.

11. El hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como un medicamento, un dispositivo médico o un producto médico.

12. Hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en

implantología, dermatología en el tratamiento de carcinomas del tracto aerodigestivo superior, durante la otorrinolaringología o medicina de oído, nariz y garganta, para el tratamiento de heridas de la cavidad oral, para el tratamiento de heridas de la cavidad oral debidas a enfermedades tumorales, durante la cirugía oral y maxilofacial, para la prevención de la cresta alveolar tras la extracción dental, en el tratamiento de defectos periodontales, incluyendo el ligamento periodontal, para el tratamiento de enfermedades en el campo de la oftalmología, para el

tratamiento de enfermedades de la córnea (humana) en un paciente por tratar, preferentemente, de la capa endotelial o epitelial de la córnea, y para el tratamiento de la distrofia endotelial de la córnea de Fuchs, para el uso en apósitos para quemaduras, parches hemostáticos, en el tratamiento de lesiones, en apósitos quirúrgicos, para el tratamiento de heridas, para la regeneración de tejido blando y duro, en el campo de la implantología, para la preparación de un implante celular para regenerar o reconstruir, íntegra o parcialmente, tejidos dañados o extirpados, para la preparación de un implante de células del sistema nervioso central como células neuronales para regenerar o reconstruir, íntegra o parcialmente, tejido neuronal, o como dispositivos de administración de fármacos o matrices celulares para aplicaciones in vitro, in vivo y/o ex vivo.

13. Kits, preferentemente de partes, que comprenden el hidrogel de PEG disoluble sensible a estímulos según lo definido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, opcionalmente, componentes adicionales para la incorporación en el hidrogel de PEG según lo definido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 y, opcionalmente, instrucciones de uso.

14. Proteína de fusión multifuncional según lo definido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 35