Formulaciones liofilizadas de VWF recombinante.

Formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende:

(a) un rVWF; (b) uno o más agentes tampón; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes estabilizantes; y (e) uno o más tensioactivos, preparándose dicha formulación mediante la liofilización de una solución que comprende:

(a) dicho rVWF, comprendiendo un polipéptido seleccionado de entre el grupo consistente en:

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3;

b) un análogo, fragmento o variante de a) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII;

c) un polipéptido codificado por el nucleótido dee SEQ ID Nº 1;

d) un análogo, fragmento o variante de c) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; y

e) un polipéptido codificado por un nucleótido que se hibrida con el polinucleótido de SEq ID Nº 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente restrictivas;

(b) comprendiendo dicho tampón un agente tampón del pH en un rango de aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM y con un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 12,0;

(c) estando presente dicho aminoácido a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM;

(d) estando presente dicho agente estabilizante a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente1.000 mM; y

(e) estando presente dicho tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0,01 g/l a 0,5 g/l.

Formulaciones liofilizadas de VWF recombinante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En general, la invención se refiere a formulaciones de VWF recombinante liofilizadas y a métodos para obtener una composición liofilizada que comprende VWF recombinante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El factor Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína circulante del plasma en forma de una serie de multímeros cuyas dimensiones varían entre unos 500 y 20.000 kD. Las formas multiméricas de VWF están compuestas por subunidades de polipeptídicas de 250 kD unidas entre sí por enlaces disulfuro. El VWF media en la adhesión inicial de las plaquetas al subendotelio de la pared del vaso dañado. Tan sólo los multímeros de mayor tamaño presentan actividad hemostática. Se asume que las células endoteliales secretan formas poliméricas de VWF de gran tamaño y que aquellas formas del VWF que tienen un menor peso molecular (VWF de bajo peso molecular) proceden de la escisión proteolítica. Los multímeros de mayor masa molecular se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales, liberándose bajo estimulación.

El VWF es sintetizado por las células endoteliales y megacariocitos como prepro-VWF, que en gran medida consiste en dominios repetidos. Al producirse la escisión del péptido de señal, el pro-VWF se dimeriza a través de enlaces disulfuro en su terminal-C. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que está controlada por los enlaces disulfuro existentes entre los terminales libres de los extremos. La formación de los multímeros va seguida de la eliminación proteolítica de la secuencia del propéptido (Leyte y col., Biochem. J. 274 (1991) , 257-261) .

El producto de traducción primario predicho a partir del ADNc (cDNA) clonado de VWF es un polipéptido precursor de 2.813 residuos (prepro-VWF) . El prepro-VWF consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, comprendiendo el VWF maduro 2.050 aminoácidos (Ruggeri Z.A. y Ware J., FASEB J., 308-316 (1993) ) .

Los defectos del VWF son la causa de la enfermedad de Von Willebrand (VWD) , que se caracteriza por un fenotipo de sangrado más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la variedad más grave, en ella el VWF está completamente ausente, y la VWD de tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa de VWF, pudiendo ser su fenotipo muy leve. La VWD tipo 2 se refiere a defectos cualitativos de la VWF y puede ser tan grave como la VWD tipo 3. La VWD tipo 2 presenta muchas sub-variedades, algunas de las cuales están asociadas a la pérdida o reducción de multímeros de alto peso molecular. El síndrome de Von Willebrand tipo 2a (VWS-2A) se caracteriza por una pérdida de multímeros de tamaño grande e intermedio. El VWS-2B se caracteriza por la pérdida de los multímeros de mayor peso molecular. En la técnica actual se conocen otras enfermedades y trastornos relacionados con el VWF.

Las patentes US Nº 6.531.577, 7.166.709, así como la Patente Europea EP 152 312 describen formulaciones de VWF obtenidas a partir de plasma. No obstante, además de las cuestiones relativas a la cantidad y la pureza del VWF obtenido a partir del plasma, también existe un riesgo de transmisión sanguínea de patógenos (por ejemplo virus, variantes de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ) ) . También es sabido que el VWF forma agregados en condiciones de estrés.

Así, en la técnica existe la necesidad de desarrollar una formulación farmacéutica estable que comprenda VWF recombinante.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona formulaciones útiles para la liofilización de VWF recombinante, que resultan en una composición farmacéutica muy estable. La composición farmacéutica estable es útil como agente terapéutico para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos o enfermedades que pueden beneficiarse de la administración de VWF recombinante.

En una realización, se proporciona una formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) según la reivindicación 1.

En otra realización, el rVWF incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 3. En otra realización de la invención, el agente tampón se selecciona de entre el grupo consistente en citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y sus combinaciones. En otra realización, el agente tampón es citrato. En diversas realizaciones, el pH está en el rango de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 8, 0, aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 7, 5 o es de aproximadamente 7, 3. En otra realización, el pH está en torno a 7, 3.

En otra realización, el aminoácido mencionado anteriormente se selecciona de entre el grupo consistente en glicina, histidina, prolina, serina, alanita y arginina. En otra realización, la concentración de aminoácido se sitúa entre aproximadamente 0, 5 mM y aproximadamente 300 mM. En otra realización adicional, el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM.

En una realización de la invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón es citrato y el pH es de aproximadamente 7, 3; siendo el aminoácido glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM.

En otra realización adicional de la invención, el o los agentes estabilizantes anteriormente mencionados se seleccionan de entre el grupo consistente en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes estabilizantes. En una realización, los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l.

En otra realización adicional de la invención, el agente tensioactivo mencionado se selecciona de entre el grupo consistente en digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de los mismos. En otra realización, el agente tensioactivo es TWEEN-80 a aproximadamente 0, 01 g/l.

En otra realización de la invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 3, siendo el agente tampón citrato a una concentración de aproximadamente 15 mM y a un pH de aproximadamente 7, 3; siendo el aminoácido glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM; siendo los agentes estabilizadores trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l.; y siendo el agente tensioactivo TWEEN-80 a una concentración de aproximadamente 0, 1 g/l.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: análisis ANCOVA de la actividad del pool de VWF:RCo en lotes evaluador en cuanto a su estabilidad (almacenados a 5ºC ± 3ºC) . Figura 2: muestra el incremento de la humedad residual en el rVWF FDP almacenado a 5ºC ± 3ºC. Figura 3: muestra el incremento de la humedad residual en el rVWF FDP almacenado a 40ºC ± 2ºC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definición de términos A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el significado normalmente entendido por el experto en el campo técnico al cual pertenece la presente invención. Las siguientes referencias facilitan al experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994) ; THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988) ; THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger y col. (eds.) , Springer Verlag (1991) ; y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991) .

Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias citadas en este documento quedan incorporadas al mismo en su totalidad por referencia, en la medida en que ello no se oponga a lo aquí descrito.

Debe tenerse en cuenta que, tal y como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un, " "una, " y "el" incluyen las referencias al plural, a menos que el contexto lo exija claramente en otro sentido.

Tal y como se utilizan en el presente documento, los siguientes términos tendrán los significados que se les atribuyen, a menos que se especifique en otro sentido.

El término “que comprende”, en relación con un compuesto péptido, significa que un compuesto puede incluir

aminoácidos adicionales tanto en el terminal amino de la secuencia dada como en el carboxilo o en ambos. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deberían interferir de forma significativa con la actividad del compuesto.... [Seguir leyendo]

1. Formulación farmacéutica estable liofilizada de un factor von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) uno o más agentes tampón; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes estabilizantes; y (e) uno o más tensioactivos, preparándose dicha formulación mediante la liofilización de una solución que comprende:

(a) dicho rVWF, comprendiendo un polipéptido seleccionado de entre el grupo consistente en: a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3; b) un análogo, fragmento o variante de a) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; c) un polipéptido codificado por el nucleótido dee SEQ ID Nº 1; d) un análogo, fragmento o variante de c) capaz de causar la aglutinación de las plaquetas

estabilizadas en presencia de ristocetina o de unirse al Factor VIII; y e) un polipéptido codificado por un nucleótido que se hibrida con el polinucleótido de SEq ID Nº 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente restrictivas;

(b) comprendiendo dicho tampón un agente tampón del pH en un rango de aproximadamente 0, 1 mM y aproximadamente 500 mM y con un pH de aproximadamente 2, 0 a aproximadamente 12, 0;

(c) estando presente dicho aminoácido a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mM;

(d) estando presente dicho agente estabilizante a una concentración de aproximadamente 0, 1 a aproximadamente1.000 mM; y

(e) estando presente dicho tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0, 01 g/l a 0, 5 g/l.

2. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3.

3. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el agente tampón se selecciona de entre el grupo consistente en citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y combinaciones de los mismos.

4. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el pH de la solución está en el rango de aproximadamente 6, 0 a aproximadamente 8, 0, por ejemplo aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 7, 5, tal como 7, 3.

5. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el agente tampón de la solución es citrato y el pH es aproximadamente 7, 3.

6. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido se selecciona de entre el grupo consistente en glicina, histidina, prolina, serina, alanina y arginina.

7. Formulación según la reivindicación 6, caracterizada porque el aminoácido está presente en un rango de concentración de aproximadamente 0, 5 mM a aproximadamente 300 mM en la solución.

8. Formulación segúne la reivindicación 7, caracterizada porque el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM en la solución.

9. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón de la solución es citrato y el pH es aproximadamente 7, 3; y porque el aminoácido es glicina a una concentración de aproximadamente 15 mM en la solución.

10. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el o los agentes estabilizantes se seleccionan de entre el grupo consistente en manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, manosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de los mismos.

11. Formulación según la reivindicación 10, caracterizada porque los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración de aproximadamente 10 g/l en la solución y manitol a una concentración de aproximadamente 20 g/l en la solución.

12. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el tensioactivo se selecciona de entre el grupo

consistente en digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de los mismos.

13. Formulación según la reivindicación 12, caracterizada porque el tensioactivo es TWEEN-80 a una concentración de aproximadamente 0, 01 g/l en la solución.

14. Formulación según la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de

aminoácidos de SEQ ID Nº 3, el agente tampón de la solución es citrato a una concentración aproximadamente 15 mM con un pH de aproximadamente 7, 3, el aminoácido es glicina a una concentración aproximadamente 15 mM en la solución, los agentes estabilizantes son trehalosa a una concentración en solución de aproximadamene 10 g/l y manitol a una concentración en solución de aproximadamente 20 g/l y el tensioactivo es TWEEN-80 a aproximadamente 0, 1 g/l en la solución.

Figura 1 Figura 2 Figura 3