Expresión de miARN en microvesículas de sangre periférica humana y usos del mismo.

Un procedimiento para diagnosticar o pronosticar cáncer de próstata en un sujeto,

que comprende:

i) aislar microvesículas de una muestra de sangre periférica del sujeto;

ii) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en las microvesículas aisladas, y

iii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en donde unaumento del nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el delcontrol, es diagnóstico o pronóstico del cáncer de próstata;

en el que se determina el nivel de miR-21 y al menos uno de los siguientes miR: miR-15a, miR-16-1, miR-143 y miR-145.

Expresión de miARN en microvesículas de sangre periférica humana y usos del mismo Antecedentes de la invención

Los microARN (miARN o miR) son ARN no codificantes pequeños expresados en animales y plantas. Regulan la función celular, supervivencia celular, activación celular y diferenciación celular durante el desarrollo.

Los microARN son una familia no codificante pequeña de ARN de 19-25 nucleótidos que regulan la expresión génica dirigiendo ARN mensajeros (ARNm) de una manera específica de secuencia, induciendo la represión de la traducción o degradación de ARNm dependiendo del grado de complementariedad entre los miARN y sus dianas (Bartel, D.P. (2004) Cell 116, 281- 297; Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355) . Muchos miR están conservados en secuencia entre organismos relacionados de forma distante, lo que sugiere que estas moléculas participan en procesos esenciales. De hecho, los miR están implicados en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo (Xu, P., y col. (2003) Curr. Biol. 13, 790-795) , proliferación celular (Xu, P., y col. (2003) Curr. Biol. 13, 790795) , apoptosis (Cheng, A.M., y col. (2005) Nucl. Acids Res. 33, 1290-1297) , metabolismo de la glucosa (Poy, M.N., y col. (2004) Nature 432, 226-230) , resistencia a tensión (Dresios, J., y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1865-1870) y cáncer (Calin, G.A, y col. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1554-15529; Calin, G.A., y col. (2004) Proc. Natl Acad. ScL USA 101, 11755-11760; He, L., y col. (2005) Nature 435, 828-833; y Lu, J., y col. (2005) Nature 435: 834-838) .

Hay pruebas sólidas de que los miR desempeñan un papel en la hematopoyesis de los mamíferos. En ratones, miR181, miR-223 y miR-142 se expresan de forma diferencial en tejidos hematopoyéticos, y su expresión está regulada durante la hematopoyesis y compromiso de linaje (Chen, C.Z., y col. (2004) Science 303, 83-86) . La expresión ectópica de miR-181 en células progenitoras hematopoyéticas murinas condujo a proliferación en el compartimento de linfocitos B (Chen, C.Z., y col. (2004) Science 303, 83-86) . La realización de perfiles génicos de miR sistemática en células del sistema hematopoyético murino reveló diferentes patrones de expresión de miR en el sistema hematopoyético en comparación con tejidos neuronales e identificó cambios de expresión de miR individuales que se producen durante la diferenciación celular (Monticelli, S., y col. (2005) Genome Biology 6, R71) . Un estudio reciente ha identificado la modulación negativa de miR-221 y miR-222 en cultivos eritropoyéticos humanos de células progenitoras de sangre del cordón umbilical CD34+ (Felli, N., y col. (2005) Proc. Natl. Acad. ScL USA. 102, 18081-18086) . Se descubrió que estos miR se dirigían al oncogén c-Kit. Los estudios funcionales adicionales indicaron que la reducción de estos dos miR en cultivos eritropoyéticos desbloquea la producción de proteína Kit al nivel de traducción lo que conduce a la expansión de células eritroides tempranas (Felli, N., y col. (2005) Proc. Natl. Acad. ScL USA. 102, 18081-18086) . En concordancia con la hipótesis de que los miR regulan la diferenciación celular, se descubrió que miR-223 es un miembro clave de un circuito regulador que implica C/EBPa y NFI-A, que controla la diferenciación granulocítica en líneas celulares leucémicas promielocíticas agudas tratadas con ácido retinoico todo trans (Fazi, F., y col. (2005) Cell 123, 819-831) . Iorio, N.V. y col. han presentado la desregulación de la expresión génica de microARN en cáncer de mama humano en Cancer Research 2005; 65: (16) , 15 de agosto de 2005. Se identificaron miARN cuya expresión se correlacionaba con características biopatológicas de cáncer de mama específicas tales como expresión del receptor de estrógenos y progesterona, estadio tumoral, invasión vascular o índice de proliferación.

Taylor, D. D. y col. han informado sobre exosomas asociados al embarazo y su modulación de la señalización de linfocitos T en el Journal of Immunology, 2006, 176: 1535-1542. Los resultados demuestran que los exosomas de embarazos con parto a término en última instancia están presentes a concentraciones significativamente mayores que los de embarazos con parto prematuro; sin embargo, los exosomas de embarazos con parto a término también muestran supresión significativamente mayor de CD3-ζ y JAK3.

Se ha identificado una deleción frecuente y expresión reducida de dos miR en leucemia linfocítica crónica de linfocitos B9. Este descubrimiento estimuló numerosos artículos que documentaban la expresión aberrante de miR en carcinomas de cabeza y cuello, cánceres pulmonares de células pequeñas, glioblastomas, cánceres de mama, leucemia linfocítica crónica y linfoma de Burkitt9-12. Más recientemente, se ha presentado una relación entre la información y los miR en macrófagos13.

Para ensayar tales trastornos, se han obtenido muestras tisulares para confirmar la presencia de dichos macrófagos. Además, hasta ahora, no ha habido ningún informe que demuestre que las microvesículas que circulan en la sangre contengan miR.

En parte se expondrán ventajas, objetos y características adicionales de la invención en la descripción a continuación y en parte resultarán evidentes para los expertos habituales en la técnica tras el examen de lo siguiente o pueden aprenderse a partir de la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención pueden realizarse y obtenerse como se apunta particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para diagnosticar o pronosticar cáncer de próstata en un sujeto, que comprende:

i) aislar microvesículas de la sangre periférica del sujeto; ii) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en las microvesículas aisladas; y iii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en el que un aumento del nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el del control, es diagnóstico o pronóstico del cáncer de próstata;

en el que se determina el nivel de miR-21 y al menos los siguientes miR: miR-15a, miR-16-1, miR-143 y miR-145.

También se desvela en el presente documento un procedimiento para diagnosticar o pronosticar una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende:

i) aislar microvesículas de la sangre periférica del sujeto; ii) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en las microvesículas aisladas; y iii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en el que un aumento en el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el del control, es diagnóstico o pronóstico de la enfermedad o trastorno;

en el que la enfermedad es adenocarcinoma de colon y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR-20a, miR-21, miR-106a, miR-181b y miR-203; en el que la enfermedad es cáncer colorrectal y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR19a, miR-21, miR-127, miR-31, miR-96, miR-135b y miR-183; y al menos los siguientes miR están regulados negativamente: miR-30c, miR-133a, miR-143, miR-133b y miR-145; en el que la enfermedad es cáncer de pulmón y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR-1792, miR-19a, miR-21, miR-92, miR-155, miR-191, miR-205 y miR-210; y al menos los siguientes miR están regulados negativamente: miR-let-7; en el que la enfermedad es cáncer de mama y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR-21 y miR-155; y al menos los siguientes miR están regulados negativamente: miR-125b y miR-145; en el que la enfermedad es linfoma de linfocitos B y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR-155, miR-17-92, miR-19a, miR-92, miR-142 miR-155, miR-221 miR-17-92, miR-19a, miR-21, miR-92, miR-155, miR-191, miR205 y miR-210; en el que la enfermedad es cáncer pancreático y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR103, miR-107, miR-18a, miR-31, miR-93, miR-221, miR-224 y miR-155; y al menos los siguientes miR están regulados negativamente: miR-133a, miR-216 miR-217; en el que la enfermedad es BCL grande difusa y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR155 y miR-17-92; en el que la enfermedad es leucemia linfocítica crónica y al menos los siguientes MiR están regulados positivamente: miR-23b, miR-24-1, miR-146, miR-155, miR-195, miR-221, miR-331, miR-29a, miR-195, miR-34a y miR-29c; y al menos los siguientes miR están regulados negativamente: miR-15a, miR-16-1, miR-29 y miR-223; en el que la enfermedad es cáncer de vejiga... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diagnosticar o pronosticar cáncer de próstata en un sujeto, que comprende:

i) aislar microvesículas de una muestra de sangre periférica del sujeto; ii) determinar el nivel de al menos un producto génico de miR en las microvesículas aisladas, y

iii) comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra con un control, en donde un aumento del nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra del sujeto, en relación con el del control, es diagnóstico o pronóstico del cáncer de próstata;

en el que se determina el nivel de miR-21 y al menos uno de los siguientes miR: miR-15a, miR-16-1, miR-143 y miR

145.

2. Uso de microvesículas aisladas como un biomarcador para cáncer de próstata, en el que el biomarcador se aísla de microvesículas en sangre periférica de un sujeto que tiene el cáncer de próstata, y al menos los siguientes miR están regulados positivamente en la microvesícula aislada en relación con los del sujeto de control: miR -21, y al menos los siguientes miR están regulados negativamente en la microvesícula aislada en relación con los del sujeto de control: miR-15a, miR-16-1, miR-143 y miR-145.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el control se selecciona del grupo que consiste en:

i) un patrón de referencia; ii) el nivel del al menos un producto génico de miR en microvesículas aisladas de un sujeto que no tiene el trastorno; y iii) el nivel del al menos un producto génico de miR en microvesículas aisladas de una muestra del sujeto que no presenta dicho trastorno.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra del sujeto comprende plasma.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 4, en el que el nivel del al menos un producto génico de miR se mide por RT-PCR, análisis de transferencia de Northern, detección de hibridación en solución y/o análisis de micromatrices.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, 4 o 5, en el que el aislamiento de microvesículas comprende 25 centrifugación.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, 4, 5 o 6, en el que miR-21 está regulado positivamente en la microvesícula aislada en relación con el del sujeto de control; y al menos uno de los siguientes miR está regulado negativamente en la microvesícula aislada en relación con el del sujeto de control: miR-15a, miR16-1, miR-143 y miR-145.

Tabla 1

Enfermedad Aumento de la expresión en tejido enfermo Reducción de la expresión en tejido enfermo Referencia

Adenocarcinoma de colon miR-20a, miR-21, miR-106a, miR181b, miR-203 JAMA. 30 ene 2008; 299 (4) :425-36; Int J Cancer. 1 mar 2008 1; 122 (5) .

96. 77.

Colorrectal miR-19a. miR-21 miR-127, miR-31, miR-96. miR-135b y miR-183, miR-30c, miR-133a, miR143, miR-133b y miR-145 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) :969-77; Cancer. 19 jul 2006; 5:29; Braz J Med Biol Res. nov 2007; 40 (11) :1435-40.

Cáncer de próstata miR-21 miR-15a, miR-16-1, miR143, miR-145 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) .

96. 77.

Cáncer de pulmón mir-17-92, miR-19a, miR-21, miR-92, miR-155. miR-191. miR-205, miRmiR-210 miR-let-7 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) .

96. 77.

Cáncer de mama miR-21, miR-155 miR-125b, miR-145 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) .

96. 77.

Linfoma de linfocitos B miR-155, miR-17-92, miR-19a, miR92, miR-142, miR-155, miR-221 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) .

96. 77.

Pancreático miR-103 y miR-107, miR-18a, miR31, miR-93. miR-221 y miR-224, miR-155 miR-133a, miR-216 , miR 217 J Clin Oncol. 10 oct 2006; 24 (29) : 4677-84; Oncogene. 28 jun 2007; 26 (30) : 4442-52

BCL grande diifuso miR-155, miR-17-92 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) .

96. 77.

CLL miR-23b, miR-24-1, miR-146, miR155, miR-195, miR-221, miR-331, miR-29a. miR-195, miR-34a y miR29c miR-15a, miR-16-1, miR-29, miR-223 Int J Cancer. 1 mar 2008; 122 (5) :969-77; Braz J Med Biol Res. nov 2007; 40 (11) :1435-40.

Cáncer de vejiga miR-223, miR-26b, miR-221, miR103-1, miR-185, miR-23b, miR-203, miR-17-5p, miR-23a y miR-205 Urol Oncol. sep-oct 2007; 25 (5) .

38. 92

Cáncer renal miR-28, miR-185, miR-27 y miR-let7f-2 Urol Oncol. sep-oct 2007; 25 (5) .

38. 92

Tumor-hipoxia miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-103, miR-107, miR-181, miR210 y miR-213 Mol Cell Biol. mar 2007; 27 (5) : 1859-67.

Leiomiomas uterinos familia miR-let-7, miR-21, miR-23b, miR-29b y miR-197 Genes Chromosomes Cancer. abr 2007;46 (4) .

33. 47

Ovárico miR-199*. miR-200a, miR-214 miR-100, grupo de. miRlet-7, miR-125b Cancer Res. 15 ene 2008; 15; 68 (2) .

42. 33

Carcinoma hepatocelular asociado con virus de la hepatitis C miR-122, miR-100 y miR-10a miR-198 y miR-145 Hepatology. 19 dic 2007 [Epub antes de la impresión]

ALL miR-128b, miR-204, miR-218, miR331 y miR-181b-1, miR-17-92 Braz J Med Biol Res. nov 2007; 40 (11) : 1435-40.

Enfermedad de Alzheimer miR-9, miR-128 miR-107 J Neurosci. 30 ene 2008; 28 (5) : 1213-23 Neuroreport. 12 feb 2007; 18 (3) .

29. 300

Mielofibrosis miR-190 miR-31, miR-150 y miR-95 Exp Hematol. nov 2007;35 (11) : 1708-18

Mielofibrosis, policetemia vera, trombocitemia miR-34a, -342, -326, -105, 149 y-147 Exp Hematol. nov 2007;35 (11) : 1708-18

VIH miR-29a, miR-29b, miR-149, miR378, miR-324-5p Biochem Biophys Res Commun. 2 dic 2005; 337 (4) : 1214-8.

Latencia de VIH-1 miR-28, miR-125b, miR-150, miR223 y miR-382 Nat Med. Oct 2007; 13 (10) :1241-7|

Figur.

6. Tabla I

Tabla III. Diez miARN más expresados en microvesículas de plasma y PBMC.

Microvesículas de plasma PBMC

miARN Expresión normalizada (± D.T.) Frecuencia expresada entre donantes ( %) 10 frecuencias de mayor clasificación ( %) miARN Expresión normalizada (± D.T.) Frecuencia expresada entre donantes ( %) 10 frecuencias de mayor clasificación ( %)

mir-223 1589 ± 653 100 100 mir-223 2143 ± 499 100 100

mir-484 50, 9 ± 22, 9 100 96 mir-150 241 ± 94, 6 98 98

mir-191 46, 4 ±14, 9 100 100 mir-146b 57, 5 ± 21, 1 100 100

mir-146a 39, 5 ± 19 100 88 mir-016 54, 7 ± 32, 9 100 100

mir-016 25, 4 ± 13, 3 100 78 mir-484 40, 6 ±18, 8 89 88

mir-026a 25, 2 ± 9, 95 100 90 mir-146a 39, 6 ±13, 0 100 98

mir-222 24, 5 ± 12, 4 100 76 mir-191 32, 4 ±15, 6 100 94

mir-024 22, 7 ± 10, 5 100 80 mir-026a 30 ± 8, 92 100 100

mir-126 18, 2 ±8, 04 100 66 mir-019b 21, 7 ± 7, 49 100 80

mir-032 15, 3 ± 32, 6 100 31 mir-020a 15 ± 5, 11 100 4

Figur.

8. Tabla III

Rutas predichas reguladas por miARN expresados en las microvesículas de plasma y fracciones de PBMC basándose en análisis de IPA solamente de dianas predichas por Sanger miRBase

Microvesículas de plasma p-valor PBMC p-valor

Metabolismo de glicerofosfolípidos 3, 29E-03 Señalización de orientación axonal 1, 47E-02

Metabolismo de inositol fosfato 5, 77E-03 Potenciación a largo plazo sináptica 2, 07E-02

Degradación de fosfolípidos 9, 17E-03 Señalización de receptores de estrógenos 2, 23E-02

Metabolismo de alanina y aspartato 1, 96E-02 Metabolismo de glicerofosfolípidos 2, 45E-02

Señalización del receptor de estrógenos 2, 14E-02 Metabolismo de D-glutamina y D-glutamato 2, 78E-02

Rutas predichas reguladas por miARN expresados en las microvesículas de plasma y fracciones de PBMC de dianas combinadas de TargetScan y Sanger miRBase

Microvesículas de plasma p-valor PBMC p-valor

Ruta de presentación de antígenos 1, 28E-03 Metabolismo de glicina, serina, treonina 3, 63E-03

metabolismo de glicerofosfolípidos 9, 05E-03 Metabolismo de glicerofosfolípidos 2, 38E-02

Metabolismo de glicina, serina, treonina 1, 56E-02 Metabolismo de D-glutamina y D-glutamato 2, 54E-02

Señalización de linfocitos citolíticos naturales 1, 57E-02 Metabolismo de glioxilato, dicarboxilato 4, 37E-02

Figur.

9. Tabla IV

plasma_media es la media de Ct en bruto en las 51 observaciones para plasma PBMC es la media de la Ct en bruto en las 51 observaciones para PBMC

"Plasma-PBMC" es la diferencia de datos normalizados entre plasma y PBMC Plasma-MNC "+": el nivel de miR es mayor en PBMC, y "---": el nivel de miR es menor en plasma "Factor de cambio" es 2^ la diferencia. Para miR 29a: 40, 3 = 2^ (5, 33) . Lo que significa que el nivel de miR en PBMC es veces mayor que en suero "p-valor" se consideró significativo si el p-valor < 0, 05/72 = 0, 0006