Estrategias mejoradas para elaboración de perfiles de transcritos usando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento.

Procedimiento para determinar niveles de transcripción relativos de una secuencia de nucleótidos en muestrasde ADNc que comprende las etapas de:

(a) Proporcionar una primera muestra de ADNc;

(b) Realizar una reducción de la complejidad reproducible de la primera muestra de ADNc 5 para obtener unaprimera colección que comprende las etapas de:

- digerir el ADNc con al menos una endonucleasa de restricción para fragmentarlo en fragmentos derestricción;

- ligar los fragmentos de restricción con al menos un adaptador oligonucleotídico sintético bicatenario quetenga un extremo compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción para producirfragmentos de restricción ligados a adaptador;

- poner en contacto dichos fragmentos de restricción ligados a adaptador con uno o más cebadoresoligonucleotídicos bajo condiciones de hibridación, teniendo dichos uno o más cebadores oligonucleotídicosuna secuencia de cebador que incluye una sección de secuencia de nucleótidos complementaria a parte delal menos un adaptador y a parte de la parte restante de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasade restricción; y

- amplificar dichos fragmentos de restricción ligados a adaptador por elongación del uno o más cebadoresoligonucleotídicos hibridados;

(c) Marcar la primera colección para obtener una primera colección marcada mediante el uso de al menos unadaptador marcado en la etapa (b);

(d) Realizar, de forma consecutiva o simultáneamente, las etapas (a) y (b) con una segunda muestra y/o unamuestra posterior de ADNc, usando una marca diferente para cada muestra de ADNc, para obtener unasegunda colección marcada y/o una colección marcada posterior;

(e) Combinar la primera colección marcada y la segunda colección marcada y/o una colección marcadaposterior para obtener una colección combinada;

(f) Determinar al menos parte de las secuencias de nucleótidos de la colección marcada mediantesecuenciación de alto rendimiento;

(g) Determinar la frecuencia de la secuencia de nucleótidos en la primera muestra de ADNc y la segundamuestra y/o una muestra posterior de ADN; y

(h) Comparar la frecuencia de la secuencia de nucleótidos en la primera muestra de ADNc con la frecuencia dela secuencia de nucleótidos en la segunda muestra y/o una muestra posterior de ADNc para obtener niveles detranscripción relativos de la secuencia de nucleótidos en las muestras de ADNc.

Estrategias mejoradas para elaboración de perfiles de transcritos usando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento

Campo técnico

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética. La invención se refiere a estrategias mejoradas para determinar la secuencia de transcritos basadas en el uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. La invención se refiere además a estrategias mejoradas para la elaboración no sesgada de perfiles de transcritos.

Antecedentes de la invención La elaboración de perfiles de transcritos es una de las tecnologías fundamentales usadas en la investigación actual en biotecnología. El principal dominio de aplicación de la elaboración de perfiles de transcritos es el descubrimiento de genes implicados en rasgos complejos. Esto incluye una amplia variedad de fenómenos biológicos tales como el descubrimiento de genes implicados en enfermedades (humanas) con el fin de identificar objetivos para el desarrollo de medicación (descubrimiento de objetivos) , descifrar rutas bioquímicas que controlan la síntesis de biomoléculas (industria de la fermentación) , analizar rasgos complejos para la cría de plantas y animales (descubrimiento de genes) y muchos otros.

Un segundo dominio de aplicación sigue la ruta inversa, es decir, usar la elaboración de perfiles de transcritos para la determinación diagnóstica rutinaria de perfiles de transcritos de (un subconjunto seleccionado de) genes con el fin de predecir un fenotipo complejo. Ejemplos de esta categoría son la clasificación molecular, el diagnóstico y la predicción de pronósticos clínicos de cáncer de mama humano (Van de Vijver et al., 2002; N. Engl. J. Med., vol. 347) 25:1999-2009; van't Veer et al., 2002, Breast Cancer Res., vol. 5 (1) : 57-8; www.agendia.com) y de carcinoma papilar de células renales (Yang et al., 2005) . Se describen enfoques para la identificación de genes pertinentes basada en datos de elaboración de perfiles de transcritos recogidos en poblaciones secretoras por Schadt y sus colaboradores (2005, Sci. STKE, vol. 296:pre40) . En resumen, la elaboración de perfiles de transcritos es de vital importancia en la investigación en ciencias biológicas.

Las tecnologías para la elaboración de perfiles de transcritos han evolucionado rápidamente durante los últimos 10 años. Hasta principios de los noventa (poco después de la disponibilidad generalizada de la PCR) , la elaboración de perfiles de transcritos se realizaba mediante análisis de bandas northern o ensayos de protección de RNasa. Aunque estas técnicas son bastante específicas y sensibles (especialmente los ensayos de protección de RNasa) , las limitaciones de estas tecnologías son que sólo se pueden analizar uno o unos pocos genes a la vez (rendimiento bajo) , al mismo tiempo que los procedimientos son tediosos y requieren mucho tiempo. Además, ambos procedimientos requieren el uso de técnicas de marcaje radiactivo, lo que supone un peligro para la salud.

Con la aparición de la técnica de presentación diferencial (PD) en 1992 (Liang y Pardee, 1992, Science, vol. 257 (5072) : 967-71) y muchas modificaciones y mejoras de la PD (p. ej., Ordered Differential Display, Matz et al., 1997, Nucl. Acids, Res., vol. 25 (12) :2541-2) , se dio un paso hacia la elaboración de perfiles de transcritos multiplexados. Las características de la PD son que subconjuntos de genes aleatorios son el objetivo mediante la hibridación poco rigurosa de un cebador de PCR diseñado aleatoriamente con la muestra de ADNc que se va a analizar, dando como resultado la amplificación preferente de transcritos expresados que contienen secuencias con alta homología con el cebador de PCR usado. Posteriormente, los productos de amplificación se resuelven en geles de secuencia, dando como resultado un patrón identificador que representa los subconjuntos de genes transcritos. Aunque los procedimientos de PD tienen un rendimiento superior en comparación con las bandas northern y los ensayos de protección de RNasa, sus limitaciones son la reproducibilidad/solidez bastante baja de estas técnicas. Esto se debe, en parte, a la hibridación inespecífica del cebador de PCR aleatorio usado. En consecuencia, los patrones identificadores generados usando diferentes cebadores aleatorios no se dirigen sistemáticamente a subconjuntos diferentes (complementarios) de transcritos. Una desventaja adicional es que los procedimientos de PD requieren la preparación de geles planos o la detección por electroforesis en gel por capilaridad. Otra limitación más es que no se conoce el origen génico de las bandas observadas en las identificaciones, lo que requiere la escisión de la banda, la elución, la reamplificación y la secuenciación del ADN que se quiere revelar; esta última limitación la comparten otros procedimientos de elaboración de perfiles de transcritos a base de identificaciones. Finalmente, con la detección de 50-100 fragmentos por carril en un gel/rastro de capilaridad, la tecnología es moderadamente multiplexada.

El procedimiento de ADNc-AFLP (Bachem et al., 1996, Plant J., vol. 9 (5) : 745-53) aborda dos de las principales limitaciones de la tecnología de PD, a saber, la reproducibilidad/solidez y la complementariedad de la información obtenida en los identificadores generados con diferentes cebadores de PCR. La solidez y la reproducibilidad del procedimiento de ADNc-AFLP es muy alta debido a que la amplificación de fragmentos de restricción ligados a adaptador usando selectivos AFLP® (Keygene N.V., Países Bajos; véanse, p. ej., el documento EP 0 534 858 y Vos P., et al. (1995) . AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, vol. 23, No. 21, p. 44074414) cebadores se produce bajo condiciones altamente rigurosas, dando como resultado patrones identificadores altamente reproducibles. Además, el uso de cebadores de AFLP selectivos con diferentes nucleótidos selectivos garantiza la obtención de identificadores que contienen información complementaria. Por consiguiente, la tecnología de ADNc-AFLP permite la toma de muestras reproducible de subconjuntos del transcriptoma. Otra ventaja del (ADNc-) AFLP (y la PD) es que no se necesita información de secuencia previa y, por lo tanto, la tecnología se puede aplicar a una amplia variedad de organismos. Las limitaciones del ADNc-AFLP son sus niveles moderados de multiplexación por carril/rastro y el hecho de que no se conoce de forma directa el origen génico de las bandas (véase también la PD) .

Las limitaciones en los niveles de multiplexación de los procedimientos de elaboración de perfiles de transcritos anteriormente descritos se han abordado tanto por SAGE (análisis en serie de la expresión génica; Velculescu et al., 1995, Science, vol. 270 (5235) : 484-7) como por secuenciación masiva de firmas en paralelo (MPSS: Brenner et al., 2000, Nature Biotechnology, vol. 18 (6) :630-4; Meyers et al., 2004, Nature Biotechnology, vol. 22 (8) :1006-11) . Al igual que el ADNc-AFLP, ambos procedimientos usan enzimas de restricción de tipo IIS para cortar el ADNc de muestra, seguido por la ligación del adaptador.

En el SAGE, los fragmentos ligados a adaptador se concatenan posteriormente y se secuencian mediante secuenciación de Sanger. A partir del rastro de secuencia de Sanger se extraen marcas de secuencia corta de 14-20 pb, proporcionado información cuantitativa sobre los genes transcritos ("northern digital") . Comparando la frecuencia de las marcas entre muestras, se obtiene información sobre los niveles de expresión relativos entre muestras estudiadas, sin la necesidad de información de secuencia previa. Aunque esto da como resultado la determinación (precisa) de la abundancia relativa del transcrito en diferentes muestras, dadas las marcas de secuencia corta obtenidas es difícil evaluar de qué genes derivan las marcas, a menos que estén disponibles las colecciones de EST grandes o la secuencia completa del genoma del organismo estudiado y puedan someterse las secuencias de marcas a búsquedas de homología tales como el análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) . Por consiguiente, aunque el SAGE es altamente multiplexado, reproducible y sólido, su valor se limita a organismos con genomas secuenciados. Otra limitación es que el procedimiento no es muy adecuado para procesar muestras grandes (rendimiento bajo) debido a los costes de la secuenciación de Sanger a gran escala.

Al contrario que el SAGE, la MPSS se basa en reacciones de secuenciación en fase sólida. Sin embargo, la MPSS presenta esencialmente las mismas limitaciones que el SAGE, es decir, que se obtienen marcas de secuencia muy cortas (aproximadamente 20 pb) , lo que limita en gran medida el seguimiento posterior (identificación génica / conversión... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar niveles de transcripción relativos de una secuencia de nucleótidos en muestras de ADNc que comprende las etapas de:

(a) Proporcionar una primera muestra de ADNc;

(b) Realizar una reducción de la complejidad reproducible de la primera muestra de ADNc para obtener una primera colección que comprende las etapas de:

-digerir el ADNc con al menos una endonucleasa de restricción para fragmentarlo en fragmentos de restricción;

-ligar los fragmentos de restricción con al menos un adaptador oligonucleotídico sintético bicatenario que

tenga un extremo compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a adaptador;

-poner en contacto dichos fragmentos de restricción ligados a adaptador con uno o más cebadores oligonucleotídicos bajo condiciones de hibridación, teniendo dichos uno o más cebadores oligonucleotídicos una secuencia de cebador que incluye una sección de secuencia de nucleótidos complementaria a parte del

al menos un adaptador y a parte de la parte restante de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; y

-amplificar dichos fragmentos de restricción ligados a adaptador por elongación del uno o más cebadores oligonucleotídicos hibridados;

(c) Marcar la primera colección para obtener una primera colección marcada mediante el uso de al menos un 20 adaptador marcado en la etapa (b) ;

(d) Realizar, de forma consecutiva o simultáneamente, las etapas (a) y (b) con una segunda muestra y/o una muestra posterior de ADNc, usando una marca diferente para cada muestra de ADNc, para obtener una segunda colección marcada y/o una colección marcada posterior;

(e) Combinar la primera colección marcada y la segunda colección marcada y/o una colección marcada 25 posterior para obtener una colección combinada;

(f) Determinar al menos parte de las secuencias de nucleótidos de la colección marcada mediante secuenciación de alto rendimiento;

(g) Determinar la frecuencia de la secuencia de nucleótidos en la primera muestra de ADNc y la segunda muestra y/o una muestra posterior de ADN; y

(h) Comparar la frecuencia de la secuencia de nucleótidos en la primera muestra de ADNc con la frecuencia de la secuencia de nucleótidos en la segunda muestra y/o una muestra posterior de ADNc para obtener niveles de transcripción relativos de la secuencia de nucleótidos en las muestras de ADNc.

2. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuenciación de alto rendimiento se realiza sobre un soporte sólido tal como una perla.

3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuenciación de alto rendimiento se basa en la secuenciación por síntesis, preferentemente en la pirosecuenciación.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuenciación de alto rendimiento comprende las etapas de:

(c1) ligar adaptadores de secuenciación a los fragmentos;

(c2) hibridar fragmentos ligados a adaptadores de secuenciación con perlas, alineándose cada perla con un solo fragmento;

(c3) emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una sola perla;

(c4) realizar una PCR de la emulsión para amplificar fragmentos ligados a adaptadores de secuencia sobre la 45 superficie de las perlas;

(c5) seleccionar / enriquecer perlas que contienen fragmentos ligados a adaptadores de secuenciación amplificados;

(c6) cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una sola perla; y (c7) generar una señal de pirofosfato.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cebador comprende además una secuencia seleccionada en el extremo 3' de la secuencia del cebador, comprendiendo dicha secuencia seleccionada 1-10 nucleótidos selectivos que son complementarios a una sección situada inmediatamente adyacente a la parte restante de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5, en el que la secuencia seleccionada del extremo 3' de la secuencia del cebador comprende 1-8 nucleótidos selectivos, preferentemente 1-5, más preferentemente 1-3.

Fig 3