Ensayo diagnóstico para la detección de una molécula o fármaco en sangre entera.

Un método para preparar una muestra de ensayo para uso en un ensayo para detectar un analito no proteicounido a un ligando intracelular,

cuyo método consiste en poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivode ensayo consistente en:

un reactivo de lisis libre de detergentes, donde dicho reactivo de lisis consiste en un glicol seleccionado entreel grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol de dos a seis átomos de carbono, y al menos unalcohol de cinco o menos carbonos, donde la razón de glicol a alcohol está en el rango seleccionado entre elgrupo consistente en 4:1 a 1:4 y 4:1 a 1:2; y

una proteasa que tiene actividad proteolítica para dicho ligando intracelular;

para formar una mezcla homogénea, donde no se usa un detergente para lisar o solubilizar la muestra de ensayo yla mezcla de lisis es compatible para uso en un inmunoensayo sin ulteriores etapas de extracción.

Ensayo diagnóstico para la detección de una molécula o fármaco en sangre entera Campo técnico Esta descripción se relaciona con el uso de una o más proteasas en la preparación de muestras para ensayos diagnósticos para reducir o eliminar el sesgo de las muestras producido por la congelación o el almacenamiento de muestras biológicas antes del ensayo.

Antecedentes Muchos analitos de interés clínico son captados por las células o se acomplejan con uno o más de otros componentes de la muestra de ensayo. Por consiguiente, para obtener una medición exacta de la cantidad de analito presente en la muestra, es necesario tratar la muestra y/o realizar el ensayo en condiciones tales que el analito se libere de las células u otro (s) componente (s) para su detección en el ensayo.

Por ejemplo, los fármacos inmunosupresores tales como tacrolimus, everolimus, temsorolimus y ciclosporina son efectivos para el tratamiento del rechazo de órganos o de tejidos tras una cirugía de trasplante, de la enfermedad del 20 injerto contra el huésped y de enfermedades autoinmunes en humanos. Durante la terapia con fármacos inmunosupresores, la monitorización de los niveles de concentración en sangre del inmunosupresor es un aspecto importante del cuidado clínico, ya que niveles insuficientes de fármaco dan lugar a rechazo del injerto (órgano o tejido) y niveles excesivos dan lugar a efectos colaterales y toxicidades no deseados. Se miden, por lo tanto, los niveles en sangre de inmunosupresor para poder ajustar las dosificaciones del fármaco con objeto de mantener el

nivel del fármaco en la concentración apropiada. Los ensayos diagnósticos para la determinación de los niveles en sangre de inmunosupresor han encontrado así un amplio uso clínico.

Inicialmente, se debe extraer y separar el inmunosupresor de los otros componentes de la muestra del paciente. El grueso del fármaco inmunosupresor en la muestra del paciente está presente en un complejo con diversas 30 moléculas "portadoras", tales como proteínas de unión. El sirolimus, el tacrolimus y la ciclosporina se encuentran predominantemente en los hematíes de los especímenes de los pacientes y se asocian con proteínas de unión específicas, FKBP para el sirolimus y el tacrolimus y ciclofilina para la ciclosporina. Para asegurar una medición precisa de la concentración de fármaco total en el espécimen, preferiblemente se libera el fármaco unido a las proteínas de unión antes de la cuantificación. Se ha abordado esto usando detergentes para lisar las células y/o solventes orgánicos para desnaturalizar las proteínas de la muestra.

Después de su extracción de las proteínas de unión, se puede medir el fármaco en una serie de formas diferentes, incluyendo por inmunoensayo o cromatografía con absorbancia o detección espectrofotométrica de masas. Los inmunoensayos para fármacos inmunosupresores están disponibles en una variedad de formatos, pero todos utilizan la unión de un anticuerpo o proteína de unión (v.g., FKBP) al fármaco inmunosupresor. Un inmunoensayo comúnmente utilizado es un ensayo que conlleva la unión de un primer anticuerpo al inmunosupresor y la unión de inmunosupresor marcado (v.g., acridinio-sirolimus) al resto de los sitios libres de unión del anticuerpo, seguido de cuantificación por detección del marcaje.

La Solicitud de Patente Europea Nº EP 0.753.744 A2, publicada el 15 de Enero de 1997, describe un método de ensayo de una muestra de sangre en cuanto a la concentración de un fármaco inmunosupresor unido a una inmunofilina. Se incuba la muestra con un detergente no iónico y una proteasa, se inactiva la proteasa y se determina la concentración del fármaco.

La Patente EE.UU. Nº 5.135.875, publicada el 4 de Agosto de 1992, describe un reactivo de precipitación consistente en una sal de zinc, un glicol y un alcohol lineal o ramificado de aproximadamente 1 a 4 átomos de carbono. El reactivo es útil para precipitar proteínas y extraer analitos hidrofóbicos (ciclosporina en particular) de una muestra de ensayo biológica, tal como sangre entera.

Resumen Esta invención se relaciona con el descubrimiento de que se pueden incorporar una o más proteasas en preparaciones (v.g., para inmunoensayos) para resolver el sesgo en la concentración de un analito (v.g., fármaco) observado entre la utilización de muestras enteras frescas no lisadas (v.g., muestras de sangre de pacientes) y de 60 muestras lisadas congeladas-descongeladas (v.g., diluyente de calibrador) . También se descubrió que la (s) proteasa (s) es/son particularmente útil (es) en la preparación de muestras para ensayos diagnósticos en donde una proteína de unión se proteoliza a lo largo del tiempo, cambiando así la afinidad por su ligando (analito) , lo que, a su vez, cambia la concentración del ligando detectado en el ensayo diagnóstico.

Así, en ciertas realizaciones, esta invención proporciona métodos de preparación de una muestra de ensayo para uso en un ensayo para la detección de un analito no proteico unido a un ligando intracelular según se define en las reivindicaciones. Los métodos típicamente implican el contacto de dicha muestra de ensayo (v.g., muestra biológica) con un reactivo de ensayo que incluye un reactivo de lisis libre de detergente según se define en la reivindicación 1 y una proteasa que tiene actividad proteolítica para el ligando intracelular, para formar una mezcla homogénea compatible para uso en un inmunoensayo sin ulteriores etapas de extracción, donde no se usa ningún detergente para lisar o solubilizar la muestra de ensayo. En diversas realizaciones, la muestra de ensayo consiste en sangre entera o en una fracción de sangre (v.g., suero) . En diversas realizaciones, la muestra de ensayo consiste en sangre humana (v.g., sangre de un humano en tratamiento con un inmunosupresor) . En diversas realizaciones, la proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en una serina proteasa, una metaloproteasa, una tioproteasa, una ácido aspártico proteasa y una ácido glutámico proteasa. En ciertas realizaciones, la proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en proteinasa K, dispasa y tripsina. El reactivo de lisis consiste en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol de dos a seis átomos de carbono y al menos un alcohol de cinco o menos carbonos (v.g., metanol, etanol, propanol y similares) . La razón de glicol a alcohol es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:4, más preferiblemente de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2. En ciertas realizaciones, la muestra de ensayo es añadida al reactivo de lisis (o a los componentes del reactivo de lisis) , para formar una mezcla de muestra:reactivo de lisis en una proporción de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:10, preferiblemente de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:5, más preferiblemente de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2. En ciertas realizaciones, el método no incluye la centrifugación de la muestra. En ciertas realizaciones, el reactivo de ensayo incluye además un competidor que compite con el analito por la unión al ligando intracelular, pero que substancialmente no tiene reacción cruzada con el sistema de captura del ligando (analito) (v.g., anticuerpo u otro ligando de captura) en el sistema de detección del ensayo. En ciertas realizaciones, el ligando intracelular es un ligando de inmunofilina. En ciertas realizaciones, el analito consiste en un fármaco inmunosupresor y el competidor consiste en una molécula diferente, aunque estructuralmente similar (v.g., un análogo) que puede ser o no un fármaco inmunosupresor. En ciertas realizaciones, el analito consiste en un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente en tacrolimus, everolimus, zotarolimus, ciclosporina y análogos de cualquiera de estos compuestos.

En ciertas realizaciones, esta descripción proporciona métodos de preparación de una muestra de ensayo para uso en un ensayo para la detección de un analito unido a un ligando intracelular. Los métodos típicamente implican el contacto de la muestra de ensayo con un reactivo consistente en un reactivo de lisis libre de detergente y una proteasa que tiene actividad proteolítica para el ligando intracelular. En diversas realizaciones, la muestra de ensayo consiste en sangre entera o en una fracción de sangre (v.g., suero) . En diversas realizaciones, la muestra de ensayo consiste en sangre humana (v.g., sangre de un humano en tratamiento con un inmunosupresor) . En diversas realizaciones, la proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en una serina proteasa, una metaloproteasa, una tioproteasa, una ácido aspártico proteasa y una ácido glutámico proteasa. En ciertas realizaciones, la proteasa es seleccionada entre el... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una muestra de ensayo para uso en un ensayo para detectar un analito no proteico unido a un ligando intracelular, cuyo método consiste en poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo 5 de ensayo consistente en:

un reactivo de lisis libre de detergentes, donde dicho reactivo de lisis consiste en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol de dos a seis átomos de carbono, y al menos un alcohol de cinco o menos carbonos, donde la razón de glicol a alcohol está en el rango seleccionado entre el

grupo consistente en 4:1 a 1:4 y 4:1 a 1:2; y una proteasa que tiene actividad proteolítica para dicho ligando intracelular;

para formar una mezcla homogénea, donde no se usa un detergente para lisar o solubilizar la muestra de ensayo y la mezcla de lisis es compatible para uso en un inmunoensayo sin ulteriores etapas de extracción. 15

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra de ensayo es seleccionada entre el grupo consistente en una muestra de ensayo que incluye sangre entera, una muestra de ensayo que incluye una fracción de la sangre, una muestra de ensayo que incluye una fracción constitutiva de la sangre y una muestra de ensayo que incluye sangre humana.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en una serina proteasa, una metaloproteasa, una cisteína proteasa, una ácido aspártico proteasa, una ácido glutámico proteasa, pepsina, proteinasa K, termolisina, dispasa, tripsina y quimotripsina.

4. El método de la reivindicación 1, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol, etanol y propanol.

5. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ensayo es añadida al reactivo de lisis en una proporción en el rango seleccionado entre el grupo consistente en 2:1 a 1:10 y 2:1 a 1:2. 30

6. El método de la reivindicación 1, donde el método no incluye la centrifugación de la muestra.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho reactivo de ensayo incluye además un

competidor que compite con el analito por la unión al ligando intracelular, pero que no presenta reacción cruzada con 35 el agente de captura en el sistema de detección del ensayo.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7, donde dicho ligando intracelular es una inmunofilina.

9. El método de la reivindicación 8, donde el analito consiste en un fármaco inmunosupresor y el competidor consiste 40 en un análogo diferente, aunque estructuralmente similar.

10. El método de la reivindicación 8, donde dicho ligando intracelular se une a un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente en tacrolimus, everolimus, zotarolimus y ciclosporina.

11. Un método para determinar la concentración de un fármaco inmunosupresor en una muestra de ensayo, cuyo método consiste en:

poner en contacto una muestra de ensayo con un reactivo de ensayo para producir una mezcla de ensayo homogénea, donde el reactivo de ensayo consiste en:

un reactivo de lisis libre de detergentes, donde dicho reactivo de lisis consiste en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol de dos a seis átomos de carbono, y al menos un alcohol de cinco o menos carbonos, donde la razón de glicol a alcohol está en el rango seleccionado entre el grupo consistente en 4:1 a 1:4 y 4:1 a 1:2; y

una proteasa que tiene actividad proteolítica para un ligando intracelular que se une a dicho fármaco inmunosupresor; y

estudiar la mezcla de lisis en cuanto a un fármaco inmunosupresor, donde el método no incluye el contacto de la muestra de ensayo con un detergente y la mezcla de lisis es compatible para uso en un inmunoensayo 60 sin ulteriores etapas de extracción.

12. El método de la reivindicación 11, donde el fármaco inmunosupresor es seleccionado entre el grupo consistente en sirolimus, tacrolimus, everolimus, zotarolimus y ciclosporina.

13. El método de la reivindicación 11, donde la muestra de ensayo es seleccionada entre el grupo consistente en una muestra de ensayo que incluye una muestra de sangre humana, una muestra de ensayo que incluye sangre entera y una muestra de ensayo que incluye una fracción de la sangre.

14. El método de la reivindicación 11, donde el método no incluye la centrifugación de la mezcla de lisis.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde dicha proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en una serina proteasa, una metaloproteasa, una cisteína proteasa, una ácido aspártico proteasa, una ácido glutámico proteasa, pepsina, proteinasa K, termolisina, dispasa, tripsina y quimotripsina.

16. El método de la reivindicación 11, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol, etanol y propanol.

17. El método de la reivindicación 16, donde la muestra de ensayo es añadida al reactivo de lisis en una proporción 15 en el rango seleccionado entre el grupo consistente en 2:1 a 1:10 y 2:1 a 1:2.

18. El método de la reivindicación 16, donde el método no incluye la centrifugación de la muestra.

19. El método de la reivindicación 11, donde dicho reactivo de ensayo incluye además un competidor que compite

con el analito por la unión al ligando intracelular, pero que no presenta reacción cruzada con un agente de captura en el sistema de detección del ensayo.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 19, donde el analito consiste en un fármaco inmunosupresor

y el competidor consiste en un fármaco inmunosupresor diferente, aunque estructuralmente similar. 25

21. Un kit de ensayo consistente en:

(a) al menos un anticuerpo o proteína capaz de unirse específicamente a al menos un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente en sirolimus, tacrolimus, everolimus, zotarolimus y 30 ciclosporina; y

(b) un reactivo de ensayo consistente en:

un reactivo de lisis no detergente, donde dicho reactivo de lisis consiste en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol de dos a seis átomos de carbono, y

al menos un alcohol de cinco o menos carbonos, donde la razón de glicol a alcohol está en el rango seleccionado entre el grupo consistente en 4:1 a 1:4 y 4:1 a 1:2; y una proteasa que degrada una inmunofilina,

donde la mezcla del reactivo de lisis es compatible para uso en un inmunoensayo sin ulteriores etapas de extracción 40 y el reactivo de lisis, cuando se mezcla con una muestra de ensayo, forma una mezcla de reactivo de lisis que es una mezcla homogénea.

22. El kit de la reivindicación 21, donde dicha proteasa es seleccionada entre el grupo consistente en pepsina,

proteinasa K, termolisina, dispasa, tripsina y quimotripsina. 45

23. El kit de ensayo de la reivindicación 21, que adicionalmente incluye una composición de control que contiene el al menos un fármaco inmunosupresor de (a) .

24. El kit de ensayo de la reivindicación 21, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol, 50 etanol y propanol.

25. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde el kit incluye además un competidor que compite con el analito por la unión a un ligando intracelular, pero que no presenta reacción cruzada con el analito en el sistema de detección del ensayo.