Ensayo de péptido natriurético de tipo B humano que tiene una reducida reactividad cruzada con otras formas péptidicas.

Un método de determinación in vitro de la gravedad de la enfermedad cardiovascular en un sujeto,

cuyo método invitro consiste en las siguientes etapas:

(a) determinación de la cantidad de hBNP en una muestra de ensayo según un inmunoensayo para cuantificar lacantidad de hBNP presente;

(b) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha muestra;

(c) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a lacantidad de hBNP en dicha muestra; y

(d) correlación de la razón molar o de la razón ponderal con la gravedad de la enfermedad cardiovascular en elsujeto, donde, si la razón es inferior a un nivel predeterminado, se determina que el sujeto tiene una mayor gravedadde la enfermedad cardiovascular, y, si la razón es superior a un nivel predeterminado, se determina que el sujetotiene una menor gravedad de la enfermedad cardiovascular;

donde dicho inmunoensayo para determinar la cantidad de hBNP tiene una reducida reactividad cruzada concualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo y consiste en las siguientes etapas:

(I) contacto de al menos un anticuerpo de captura que se une a hBNP y que ha sido inmovilizado sobre una fasesólida para producir un anticuerpo inmovilizado con dicha muestra de ensayo, para formar una primera mezcla quecontiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP, donde dicho anticuerpo de captura comprendeuno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3,0 x10-7 y aproximadamente 1,0 x 10-13 M;

(II) contacto de dicha primera mezcla que contiene el complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP con almenos un anticuerpo de detección que se une al hBNP y que ha sido conjugado a un marcaje detectable, paraformar una segunda mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos unanticuerpo de detección, donde el anticuerpo de detección comprende uno o más anticuerpos que tienen unaconstante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3,0 x 10-7 y aproximadamente 1,0 x 10-13 M; y

(III) determinación de la cantidad del complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpode detección formado en la etapa (II) detectando el marcaje detectable como medida de la cantidad de hBNPcontenido en la muestra de ensayo,

donde el al menos un anticuerpo de captura y el al menos un anticuerpo de detección, cuando se utilizanconjuntamente, exhiben una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20% con cualquier proBNPhumano presente en la muestra de ensayo.

Ensayo de péptido natriurético de tipo B humano que tiene una reducida reactividad cruzada con otras formas peptídicas

Campo técnico La presente descripción se relaciona con ensayos para detectar y/o cuantificar la cantidad de péptido natriurético de tipo B humano en una muestra de ensayo. Específicamente, los ensayos de la presente descripción exhiben menos de aproximadamente un veinte por ciento (20%) de reactividad cruzada con cualquier péptido natriurético de tipo proB humano presente o contenido en una muestra de ensayo.

Antecedentes El péptido natriurético atrial (de aquí en adelante "ANP") , el péptido natriurético de tipo B (de aquí en adelante "BNP") , el péptido natriurético de tipo C (de aquí en adelante "CNP") y el péptido natriurético de Dendroaspis (de aquí en adelante "DNP") son cada uno miembros de una familia de hormonas conocidas como "péptidos natriuréticos". El ANP y el BNP comparten un amplio espectro de propiedades biológicas y pertenecen al sistema natriurético cardíaco. Tanto el ANP como el BNP tienen su origen en las células del miocardio, mientras que el CNP tiene su origen en las células endoteliales. El DNP fue aislado del veneno de la serpiente mamba verde y posee similitud estructural con ANP, BNP y CNP.

El ANP es segregado por el corazón en las aurículas. El ANP tiene un anillo de 17 aminoácidos cerrado por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína. Once de los diecisiete aminoácidos del anillo se conservan en ANP, BNP, CNP y DNP. Además de la estructura de anillo de 17 aminoácidos, el ANP tiene una cola amino-terminal de 6 aminoácidos y una cola carboxi-terminal de 5 aminoácidos. El ANP se produce como una forma pro-ANP de 126 aminoácidos que constituye la forma principal de almacenamiento del ANP. Tras escisión proteolítica entre los aminoácidos 98 y 99, el péptido maduro de 28 aminoácidos ANP se encuentra en el plasma del seno coronario (véase Yandle, J. Internal Med., 235: 561-576 (1994) ) .

El BNP recibió su nombre por ser aislado por primera vez del cerebro porcino, por lo que, inicialmente, "BNP" significaba "péptido natriurético cerebral". Sin embargo, dado que se vio que el BNP pertenecía al sistema natriurético cardíaco, se cambió la palabra "cerebral" a "de tipo B". Por lo tanto, "BNP" se refiere ahora a "péptido natriurético de tipo B". En humanos, el BNP es segregado por el corazón a través del seno coronario, predominantemente desde los ventrículos cardíacos. El precursor del pre-propéptido del BNP humano (de aquí en adelante " pre-proBNP humano") tiene una longitud de 134 aminoácidos (SEC ID Nº 1) e incluye un corto péptido señal, que se escinde enzimáticamente para liberar el propéptido humano de BNP (de aquí en adelante "proBNP humano") , que tiene una longitud de 108 aminoácidos (SEC ID Nº 2) . El proBNP humano se escinde además en un propéptido N-terminal del BNP humano (de aquí en adelante "proBNP-NT humano") , que tiene una longitud de 76 aminoácidos (SEC ID Nº 3) y la hormona activa, el BNP humano (de aquí en adelante "hBNP" o "hBNP-32") , que tiene una longitud de 32 aminoácidos (SEC ID Nº 4) . Se ha sugerido que el proBNP-NT humano, el hBNP-32 y el proBNP humano pueden circular cada uno en el plasma humano (véanse Tateyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 185 : 760-7 (1992) ; Hunt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 1175-83 (1995) ) .

El CNP fue por primera vez encontrado en el cerebro; sin embargo, se origina en su mayoría en las células endoteliales y renales. Está ampliamente distribuido en la vasculatura, el cerebro, el hueso y el endotelio. Hay poca presencia, de haberla, de CNP en el corazón. El Pro-CNP es un péptido de 103 aminoácidos que se procesa para dar o bien CNP-53 (aminoácidos 51 a 103) o bien CNP-22 (aminoácidos 82 a 103) , que son los péptidos activos. Como el ANP, el CNP tiene un anillo de 17 aminoácidos cerrado por un enlace disulfuro entre residuos de cisteína. Además de esta estructura de anillo de 17 aminoácidos, el CNP-22 tiene una cola amino-terminal de 5 aminoácidos y no contiene cola carboxi-terminal. El CNP-53 es idéntico al CNP-22, excepto por una extensión de 31 aminoácidos en el extremo amino-terminal.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el DNP fue aislado del veneno de la serpiente mamba verde. La forma madura del DNP está constituida por 38 aminoácidos. Se ha descrito inmunorreactividad de tipo DNP (DNP-LI) en el plasma humano y se ha visto que la concentración plasmática de DNP-LI está elevada en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (véase Cataliotti et al., Mayo Clin. Proc., 76: 111-1119 (2001) ) . Adicionalmente, se sabe también que la infusión de DNP sintético da lugar a natriuresis y diuresis marcadas en asociación con un aumento en plasma y orina de monofosfato cíclico de guanosina. Id.

En humanos, la enfermedad cardíaca puede estimular la secreción de ANP y BNP. De hecho, la secreción de ANP y BNP en humanos refleja típicamente un cambio en la función cardíaca. Específicamente, la secreción de ANP típicamente se acelera cuando la aurícula sufre una carga, mientras que la biosíntesis y secreción de BNP se estimulan cuando el ventrículo sufre una carga. Por lo tanto, tanto el ANP como el BNP son útiles como indicadores en el diagnóstico de la enfermedad cardíaca. Sin embargo, a pesar de esto y a lo largo del tiempo, se ha reconocido al BNP como un indicador de utilidad en el diagnóstico de la enfermedad cardíaca, más que el ANP. Por ejemplo, la

concentración en sangre del BNP es sólo 1/6 de la del ANP en un sujeto normal, pero se vuelve mayor que la del ANP en pacientes con insuficiencia cardíaca. Más aún, la concentración en sangre del BNP aumenta en el caso de la insuficiencia cardíaca como la del ANP, y la concentración en plasma del BNP con frecuencia supera la del ANP, reflejando así con mayor precisión la gravedad de la disfunción cardíaca. Más aún, el nivel de BNP en pacientes con insuficiencia cardíaca aumenta a veces en múltiplos de varias decenas a varias centenas con respecto al de sujetos normales sanos.

Se sabe que el proBNP humano, el proBNP-NT humano y el hBNP pueden circular y pueden ser detectados en muestras de ensayo de pacientes que sufren de enfermedad cardiovascular, particularmente de insuficiencia cardíaca. Tanto el hBNP como el proBNP-NT humano son usados con frecuencia como marcadores para detectar la insuficiencia cardíaca y para valorar su riesgo en los pacientes. Sin embargo, no está clara la cantidad real de cada una de las formas individuales del BNP (es decir, proBNP humano, proBNP-NT humano y BNP humano) que circulan, debido a las reactividades cruzadas de los ensayos comerciales actuales para estas diversas formas (véase Liang F. et al., J. American College of Cardiology, 49 (10) : 1071-1078 (2007) ) .

Adicionalmente, es sabido que el proBNP humano y el proBNP-NT humano pueden glicosilarse (véase Schellenberger, U. et al., Archives of Biochemistr y and Biophysics, 451: 160-166 (2006) ) , y se han aislado estas formas glicosiladas de muestras humanas (véanse Hammerer-Lercher A. et al., Clinical Chemistr y , 54 (5) : 858-865 (2008) , y Seferian, K. et al., Clinical Chemistr y , 54 (5) : 866-873 (2008) ) . Existen siete sitios de posible glicosilación confinados en una región de 36 aminoácidos en la porción N-terminal del péptido (del aminoácido 36 al 71) . Los anticuerpos generados para esta región pueden o no unirse a muestras que contengan el analito proBNP o proBNP-NT humano, dependiendo de: 1) el inmunógeno usado para producir el anticuerpo y 2) si el analito está o no glicosilado. Ensayos eventuales para el proBNP y el proBNP-NT humanos deberían usar anticuerpos que eviten estas regiones.

El artículo de Lam et al. en Journal of American College of Cardiology, vol. 49, nº 11, 2007, páginas 1193-1202, habla de la presencia de formas circulantes alternas de proBNP y BNP como evidenciadora de un procesado diverso de proBNP y BNP en la población general y concluye que las consecuencias fisiológicas de estas observaciones, tanto en términos de rendimiento del ensayo como de actividad del BNP endógeno merecen un mayor estudio.

En vista de lo cual, se necesitan en la técnica nuevos ensayos para cuantificar la cantidad de BNP humano, en particular ensayos que tengan una reducida reactividad cruzada con otras formas del péptido, y especialmente al entenderse cualquier significación clínica de la varianza en sus concentraciones circulantes individuales (v.g., frente a otras formas) . La presente descripción busca proporcionar nuevos ensayos y métodos.

Los métodos pueden ser utilizados en ensayos cualitativos o cuantitativos para el BNP humano, incluyendo ensayos realizados para valorar... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación in vitro de la gravedad de la enfermedad cardiovascular en un sujeto, cuyo método in vitro consiste en las siguientes etapas:

(a) determinación de la cantidad de hBNP en una muestra de ensayo según un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de hBNP presente;

(b) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha muestra;

(c) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a la cantidad de hBNP en dicha muestra; y

(d) correlación de la razón molar o de la razón ponderal con la gravedad de la enfermedad cardiovascular en el sujeto, donde, si la razón es inferior a un nivel predeterminado, se determina que el sujeto tiene una mayor gravedad de la enfermedad cardiovascular, y, si la razón es superior a un nivel predeterminado, se determina que el sujeto tiene una menor gravedad de la enfermedad cardiovascular;

donde dicho inmunoensayo para determinar la cantidad de hBNP tiene una reducida reactividad cruzada con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo y consiste en las siguientes etapas:

(I) contacto de al menos un anticuerpo de captura que se une a hBNP y que ha sido inmovilizado sobre una fase sólida para producir un anticuerpo inmovilizado con dicha muestra de ensayo, para formar una primera mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP, donde dicho anticuerpo de captura comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M;

(II) contacto de dicha primera mezcla que contiene el complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP con al menos un anticuerpo de detección que se une al hBNP y que ha sido conjugado a un marcaje detectable, para formar una segunda mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección, donde el anticuerpo de detección comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M; y

(III) determinación de la cantidad del complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección formado en la etapa (II) detectando el marcaje detectable como medida de la cantidad de hBNP contenido en la muestra de ensayo,

donde el al menos un anticuerpo de captura y el al menos un anticuerpo de detección, cuando se utilizan conjuntamente, exhiben una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20% con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo.

2. El método in vitro de la reivindicación 1, donde la enfermedad cardiovascular es seleccionada entre el grupo consistente en enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad vascular periférica, hipertensión, infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca.

3. Un método de monitorización in vitro de la progresión de la enfermedad cardiovascular en un sujeto, cuyo método in vitro consiste en las siguientes etapas:

(a) determinación de la cantidad de hBNP en la muestra de ensayo según un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de hBNP;

(b) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha muestra;

(c) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a la cantidad de hBNP en dicha muestra; y

(d) correlación de la razón molar o de la razón ponderal con la progresión de la enfermedad en el sujeto, donde la razón es inferior en comparación con la de una muestra de ensayo anterior del sujeto con progresión y la razón está inalterada o es superior en comparación con la de una muestra de ensayo anterior del sujeto sin progresión o con mejoría de la enfermedad cardiovascular;

donde dicho inmunoensayo para determinar la cantidad de hBNP tiene una reducida reactividad cruzada con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo y consiste en las siguientes etapas:

(I) contacto de al menos un anticuerpo de captura que se une a hBNP y que ha sido inmovilizado sobre una fase sólida para producir un anticuerpo inmovilizado con dicha muestra de ensayo, para formar una primera mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP, donde dicho anticuerpo de captura comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M;

(II) contacto de dicha primera mezcla que contiene el complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP con al menos un anticuerpo de detección que se une al hBNP y que ha sido conjugado a un marcaje detectable, para formar una segunda mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección, donde el anticuerpo de detección comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M; y

(III) determinación de la cantidad del complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección formado en la etapa (II) detectando el marcaje detectable como medida de la cantidad de hBNP contenido en la muestra de ensayo,

donde el al menos un anticuerpo de captura y el al menos un anticuerpo de detección, cuando se usan conjuntamente, exhiben una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20% con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo.

4. El método in vitro de la reivindicación 3, donde se realiza dicha monitorización después del tratamiento de la enfermedad cardiovascular.

5. Un método de identificación in vitro de un sujeto que se beneficiaría del tratamiento con un derivado del péptido natriurético para la enfermedad cardiovascular, cuyo método in vitro consiste en las siguientes etapas:

(a) determinación de la cantidad de BNP humano en una muestra de ensayo de un sujeto que exhibe uno o más indicios clínicos asociados a enfermedad cardiovascular, cuya determinación es llevada a cabo con un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de hBNP;

(b) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha muestra;

(c) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a la cantidad de hBNP en dicha muestra;

(d) determinación de si la razón molar o la razón ponderal determinada en la etapa (c) es superior o inferior a un nivel predeterminado; y

(e) identificación de si el sujeto se beneficiaría del tratamiento con un derivado del péptido natriurético en base a la determinación de la etapa (d) , donde, si la razón es inferior en comparación con el nivel predeterminado, se identifica al sujeto como un sujeto que no se beneficiaría del tratamiento con un derivado del péptido natriurético, y además donde, si la razón es superior a un valor predeterminado, entonces se identifica al sujeto como un sujeto que se beneficiaría del tratamiento con un derivado del péptido natriurético;

donde dicho inmunoensayo para determinar la cantidad de BNP humano tiene una reducida reactividad cruzada con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo y consiste en las siguientes etapas:

(I) contacto de al menos un anticuerpo de captura que se une a hBNP y que ha sido inmovilizado sobre una fase sólida para producir un anticuerpo inmovilizado con dicha muestra de ensayo, para formar una primera mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP, donde dicho anticuerpo de captura comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M;

(II) contacto de dicha primera mezcla que contiene el complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP con al menos un anticuerpo de detección que se une al hBNP y que ha sido conjugado a un marcaje detectable, para formar una segunda mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección, donde el anticuerpo de detección comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M; y

(III) determinación de la cantidad del complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección formado en la etapa (II) detectando el marcaje detectable como medida de la cantidad de hBNP contenido en la muestra de ensayo,

donde el al menos un anticuerpo de captura y el al menos un anticuerpo de detección, cuando se utilizan conjuntamente, exhiben una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20% con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo.

6. El método in vitro de la reivindicación 5, donde el derivado del péptido natriurético es la nesiritida.

7. Un método de determinación in vitro de si un sujeto ha sufrido una complicación cardiovascular como resultado de la administración a dicho sujeto de una o más composiciones farmacéuticas, cuyo método in vitro consiste en las siguientes etapas:

(a) determinación de la cantidad de BNP humano en una muestra de ensayo antes de haber administrado al sujeto una o más composiciones farmacéuticas con un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de hBNP presente en una muestra de ensayo;

(b) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha muestra;

(c) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a la cantidad de hBNP en dicha muestra;

(d) determinación de la cantidad de BNP humano en una segunda muestra de ensayo del sujeto después de haber administrado al sujeto una o más composiciones farmacéuticas, cuya determinación es llevada a cabo con dicho inmunoensayo;

(e) determinación de la cantidad de proBNP humano en dicha segunda muestra de ensayo;

(f) determinación de la razón molar o de la razón ponderal de la cantidad de proBNP humano con respecto a la

cantidad de hBNP en dicha segunda muestra de ensayo; y

(g) comparación de la razón molar o de la razón ponderal determinada en la etapa (c) con la razón molar o la razón ponderal de la etapa (f) , donde, si la razón molar o la razón ponderal determinada en la etapa (c) está inalterada cuando se compara con la razón molar o la razón ponderal determinada en la etapa (f) , entonces se determina que el sujeto no ha sufrido una complicación cardiovascular como resultado de la administración de una o más composiciones farmacéuticas, y además donde, si la razón molar o la razón ponderal determinada en la etapa (c) está alterada cuando se compara con la razón molar o la razón ponderal determinada en la etapa (f) , entonces se determina que el sujeto ha sufrido una complicación cardiovascular como resultado de la administración de una o más composiciones farmacéuticas;

donde dicho inmunoensayo para determinar la cantidad de BNP humano tiene una reducida reactividad cruzada con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo y consiste en las siguientes etapas:

(I) contacto de al menos un anticuerpo de captura que se une a hBNP y que ha sido inmovilizado sobre una fase sólida para producir un anticuerpo inmovilizado con dicha muestra de ensayo, para formar una primera mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP, donde dicho anticuerpo de captura comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M;

(II) contacto de dicha primera mezcla que contiene el complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP con al menos un anticuerpo de detección que se une al hBNP y que ha sido conjugado a un marcaje detectable, para formar una segunda mezcla que contiene un complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección, donde el anticuerpo de detección comprende uno o más anticuerpos que tienen una constante de disociación en equilibrio (KD) de entre aproximadamente 3, 0 x 10-7 y aproximadamente 1, 0 x 10-13 M; y

(III) determinación de la cantidad del complejo de al menos un anticuerpo de captura-hBNP-al menos un anticuerpo de detección formado en la etapa (II) detectando el marcaje detectable como medida de la cantidad de hBNP contenido en la muestra de ensayo,

donde el al menos un anticuerpo de captura y el al menos un anticuerpo de detección, cuando se usan conjuntamente, exhiben una reactividad cruzada de menos de aproximadamente el 20% con cualquier proBNP humano presente en la muestra de ensayo.

Figura 4