Diagnóstico clínico de una fibrosis hepática utilizando la cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina.

Método para detectar una fibrosis, que comprende:

a) determinar el nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-α

-tripsina en unamuestra biológica obtenida de un paciente; y

b) comparar dicho nivel de (a) con un nivel de control de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 deinhibidor de inter-α-tripsina a fin de determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha fibrosis.

Diagnóstico clínico de una fibrosis hepática utilizando la cadena pesada H4 de inhibidor de inter-alfa-tripsina.

Campo de la invención La presente solicitud se refiere generalmente a métodos para diagnosticar una fibrosis hepática utilizando un panel de anticuerpos dirigidos contra un nuevo panel de biomarcadores de fibrosis. Estas nuevas proteínas también pueden servir como biomarcadores para hepatitis y carcinoma hepatocelular (HCC) , así como dianas farmacéuticas para cicatrización hepática y HCC.

Antecedentes de la invención Fibrosis hepática. La fibrosis hepática (fibrosis del hígado) es una respuesta de curación de heridas caracterizada por la acumulación excesiva de tejido cicatrizal (es decir, matriz extracelular) en el hígado. Los elementos estructurales normales de los tejidos son sustituidos por cantidades excesivas de tejido cicatrizal no funcional. La biopsia hepática con aguja es la herramienta principal para el diagnóstico y evaluación de fibrosis, aunque existe un número de limitaciones y desventajas bien documentadas para esta técnica, incluyendo malestar del paciente, dolor, hemorragia, y, en casos raros, muerte. Además, una biopsia puede ser poco fiable si la fibrosis no es homogénea por todo el hígado. La fibrosis hepática puede estar provocada por diversos factores, incluyendo alcohol y virus.

Cirrosis. La cirrosis hepática es la forma más grave de cicatrización del hígado, y, a diferencia de la fibrosis hepática, generalmente se considera que es irreversible y nodular. La cirrosis es la causa de alrededor de 6000 muertes cada año en el Reino Unido y aproximadamente 27.000 en los Estados Unidos de América, convirtiéndola en la novena causa principal de muerte (MacSween et al., (2002) , Pathology of the Liver, 4ª Edición, Churchill Livingstone) . La cirrosis es un factor de riesgo importante para HCC, y, en esta etapa de cáncer hepático, el único enfoque curativo es el transplante de hígado. En el caso de cáncer hepático inducido víricamente, la cicatrización hepática y HCC pueden repetirse tras el transplante. Es imperativo diagnosticar la fibrosis en las etapas tempranas de la cicatrización hepática reversible, de manera que se pueda evitar la cirrosis irreversible.

Virus de la hepatitis C. Aproximadamente 170 millones de personas en el mundo, es decir, 3% de la población mundial (véase, por ejemplo, OMS J. Viral. Hepat. 1999; 6: 35-47) , y aproximadamente 4 millones de personas en los Estados Unidos de América están infectados con el virus de la hepatitis C (HCV, HepC) . El HCV es de las causas principales de fibrosis y cirrosis hepáticas. Alrededor de 80% de los individuos infectados de forma aguda con HCV se convierten en infectados crónicamente. Por tanto, el HCV es una causa importante de hepatitis crónica. Una vez infectado crónicamente, el virus casi nunca se elminará sin tratamiento. En casos raros, la infección por HCV provoca enfermedad clínicamente aguda, e incluso insuficiencia hepática. La infección crónica por HCV puede variar drásticamente entre individuos, en los que algunos tendrán enfermedad hepática clínicamente insignificante o mínima y nunca desarrollarán complicaciones, y otros tendrán hepatitis crónica clínicamente aparente y pueden continuar desarrollando fibrosis y cirrosis. Alrededor del 20% de los individuos con HCV que desarrollan cirrosis desarrollarán enfermedad hepática de estadio final y tendrán un mayor riesgo de desarrollar cáncer hepático primario.

Existe la necesidad de métodos mejorados para diagnosticar una fibrosis hepática y una cirrosis en pacientes.

Sumario de la invención La presente invención proporciona métodos para la detección de fibrosis.

En una forma de realización, la invención proporciona un método para detectar fibrosis, que comprende: (a) determinar el nivel de al menos un fragmento de la cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y (b) comparar dicho nivel (a) con un nivel de control de dicho fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina a fin de determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha fibrosis. Estos biomarcadores se pueden aplicar a cualquier enfermedad que presenten fibrosis, tal como fibrosis hepática, fibrosis renal, fibrosis cardíaca, fibrosis de la piel, fibrosis pancreática, etc., pero en formas de realización específicas la fibrosis es fibrosis hepática. En otras formas de realización, la fibrosis incluye regulación diferencial de fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina. En otras formas de realización, la muestra se toma de sangre, suero o plasma.

En otra forma de realización, la presente solicitud describe un método para detectar un polipéptido asociado con HF, que comprende: a) aislar una muestra biológica de un paciente con fibrosis, b) aislar una muestra biológica de un paciente sin fibrosis, c) analizar las muestras de a) y b) usando 2D-PAGE, y d) comparar los resultados de 2D-PAGE para identificar polipéptidos con expresión diferencial entre pacientes con y sin fibrosis.

En otra forma de realización, la actual invención proporciona un método para evaluar la gravedad de la fibrosis, que comprende: a) determinar el nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y b) comparar dicho nivel de fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en dicha muestra biológica del paciente con el nivel predeterminado de dichos polipéptidos asociados con HF en una población de pacientes que oscilan desde sin fibrosis hasta cirrosis.

La presente solicitud también describe un kit útil para el pronóstico de la fibrosis, que comprende un agente asociado con HF en el que el agente detecta específicamente polipéptidos asociados con HF. En formas de realización específicas, el agente es un anticuerpo o su equivalente funcional que se une a polipéptidos asociados con HF. Estos anticuerpos se pueden usar para realizar un ensayo ELISA. El kit puede comprender además al menos una diana específicamente para detectar otro gen o producto génico útil como un indicador de pronóstico.

En otra realización, la actual invención proporciona un método para determinar el pronóstico de la fibrosis, que comprende: (a) determinar el nivel de fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y (b) comparar dicho nivel de (a) con un nivel de control de dicho fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina a fin de determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha fibrosis.

Preferiblemente, el nivel de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina se determina:

a) analizando la muestra biológica del paciente y una muestra biológica de un paciente sin fibrosis usando 2D-PAGE; y

b) comparar los resultados de 2D-PAGE.

Preferiblemente, el método descrito anteriormente comprende además la detección de al menos otro polipéptido escogido del grupo que consiste en: apolipoproteína L1 (Apo L1) , fragmentos de a2 macroglobulina (a2M) escindidos de tioléster, cadenas º de haptoglobina, y fragmentos de Complemento C3 escindidos de tioléster.

Breve descripción de los dibujos Figuras 1 a 4. Estas figuras muestran los cambios observados en la expresión de los nuevos biomarcadores principales. Cada imagen muestra una región aumentada del gel 2D-PAGE con la posición relativa de la proteína identificada con un círculo. Las imágenes de gel de suero representativas se muestran para individuos sanos y pacientes con cirrosis.

Figura 1. Se muestra que la proteína semejante a antígeno CD5 está ausente en suero normal pero presente en suero de pacientes cirróticos.

Figura 2. Se muestra que la apolipoproteína L1 está presente en suero normal pero ausente en suero de pacientes cirróticos.

Figura 3. Cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina. Se encontró que este inhibidor se escindió en fragmentos de 35 y 70 kDa en muestras de suero de individuos normales. El suero de pacientes con cirrosis mostró una ausencia del fragmento de 35 kDa y una expresión disminuida del fragmento de 70 kDa, sugiriendo una menor escisión de esta proteína.

Figura 4. Se muestra que la º2 glucoproteína I está ausente en suero normal pero presente en suero de los pacientes cirróticos.

Figura 5. Esta figura demuestra que la escisión de a2 macroglobulina aumenta con la fibrosis. Las imágenes mostradas son imágenes aumentadas (como en las Figuras 1-4) pero muestran perfiles de manchas de suero de individuos sanos, pacientes con fibrosis leve, fibrosis moderada... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar una fibrosis, que comprende:

a) determinar el nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y

b) comparar dicho nivel de (a) con un nivel de control de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina a fin de determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha fibrosis.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la fibrosis incluye la regulación diferencial de dicho fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es suero. 15

4. Método para evaluar la gravedad de la fibrosis, que comprende:

a) determinar el nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y 20

b) comparar dicho nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en dicha muestra biológica del paciente con el nivel predeterminado de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una población de pacientes que comprende desde sin fibrosis a cirrosis.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la fibrosis incluye la regulación diferencial de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina.

6. Método para determinar el pronóstico de una fibrosis, que comprende:

a) determinar el nivel de al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina en una muestra biológica obtenida de un paciente; y

b) comparar dicho nivel de (a) con un nivel de control de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de 35 inhibidor de inter-a-tripsina a fin de determinar un diagnóstico positivo o negativo de dicha fibrosis.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 o 6, en el que dicha fibrosis es una fibrosis hepática.

8. Método según la reivindicación 6, en el que la fibrosis se caracteriza por una regulación diferencial de dicho al 40 menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el nivel de dicho al menos un fragmento de cadena pesada H4 de inhibidor de inter-a-tripsina se determina:

a) analizando una muestra biológica procedente del paciente y una muestra biológica procedente de un paciente sin fibrosis, usando un.

2. PAGE; y

b) comparando los resultados de l.

2. PAGE.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además detectar al menos otro polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: apolipoproteína L1 (Apo L1) , fragmentos escindidos de tioléster de a2 macroglobulina (a2M) , cadenas de haptoglobina, y fragmentos escindidos de tioléster del complemento C3.