Determinación de la eficacia de 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC mediante el análisis de la expresión génica.

Un método in vitro o ex vivo para la determinación de la eficacia de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) en laprevención y/o el tratamiento de cáncer colorrectal en un mamífero,

que comprende medir la inhibición delmecanismo de la ß-catenina en presencia de 5-ASA, que se caracteriza por que comprende la medición de laexpresión de μ-protocaderina.

Determinación de la eficacia de 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC mediante el análisis de la expresión génica La presente invención está dirigida a un método para la determinación de la eficacia de 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC en un mamífero, que comprende el análisis de la inhibición del mecanismo de º-catenina y la activación de genes onco-supresores independientes en presencia de 5-ASA. Más detalladamente, está dirigida a un método para la determinación de la eficacia de 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC en un mamífero que comprende medir la expresión de al menos un gen implicado en la regulación del mecanismo de señalización de º-catenina y de otros genes onco-supresores.

Antecedentes de la técnica Los fármacos anti-inflamatorios no esteroides (NSAIDs, del inglés “non steroidal anti-inflammator y drugs”) se caracterizan por una actividad quimiopreventiva bien reconocida contra el cáncer colorrectal (CRC, del inglés “colorectal cancer”) 1, 2. Dicha actividad ha sido observada en la población general, así como en pacientes que exhiben un riesgo aumentado de desarrollar la mencionada enfermedad. Desafortunadamente, la toxicidad sistémica y gastrointestinal de los NSAIDs limita drásticamente su administración en el contexto de los protocolos clínicos que requieren un tratamiento a largo plazo de los pacientes implicados. Tanto los efectos terapéuticos como los efectos tóxicos provocados por estos compuestos dependen enormemente de la inhibición de las enzimas COX-1 y COX-2 que, a su vez, es responsable de una síntesis reducida de prostaglandinas (PG) que normalmente median en una serie de funciones biológicas. Por lo tanto, es posible establecer que las propiedades farmacológicas de los NSAIDs residen sustancialmente en su capacidad para interferir con dichas funciones. Varios informes indican que la mesalacina (ácido 5-aminosalicílico ó 5-ASA) puede ser una alternativa prometedora para alcanzar una actividad quimiopreventiva anti-CRC comparable, evitando al mismo tiempo los efectos secundarios inducidos por los NSAIDs3-5. De hecho, a pesar de la similitud química con la aspirina, esto es un NSAID paradigmático, el 5-ASA se caracteriza por una débil actividad inhibidora de COX, una característica que es claramente importante para la seguridad clínica de dicho agente terapéutico. Mecanismos no sorprendentemente distintos parecen mediar en el efecto anti-inflamatorio del 5-ASA y, entre ellos, un papel importante es probablemente desempeñado por la inhibición de factores de transcripción que promueve la respuesta inmune tal como NFkB y PPARs6. Se ha señalado que la eficacia quimiopreventiva del 5-ASA ha sido demostrada exclusivamente, hasta la fecha, en pacientes afectados por Enfermedades Inflamatorios del Intestino (IBD, del inglés “Inflammator y Bowel Diseases”) (Enfermedad de Crohn y Colitis Ulcerativa) , que se caracterizan por un riesgo incrementado por desarrollar CRC, y aún debe confirmarse en otras categorías individuales tales como gente sana o pacientes que presenten síndromes tumorales genéticos. Aunque esto se puede determinar unívocamente a través de ensayos clínicos diseñados específicamente que podrían ayudar a clarificar la posibilidad de quimioprevención anti-CRC con 5-ASA, una caracterización adecuada de los efectos anti-tumorales que este compuesto ejerce a nivel celular y molecular podría proporcionar una contribución fundamental a dichos estudios. Los resultados de esta investigación, de hecho, podrían corroborar la racionalidad biológica de protocolos clínicos que analizan la eficacia quimiopreventiva del 5-ASA y que permiten la identificación de marcadores biológicos capaces de monitorizar la respuesta farmacológica al tratamiento considerado. A este respecto, una cantidad creciente de evidencias indica que la estimulación con 5-ASA determina una serie de efectos biológicos sobre células de cáncer de colon tales como la inhibición de la proliferación, la inducción de apoptosis y el potenciamiento de los puntos clave del ciclo celular y los procesos de reparación de ADN7-10. De forma interesante, se ha demostrado recientemente que el 5-ASA interfiere con el mecanismo de señalización de º-catenina inhibiendo la traslocalización nuclear de º-catenina, necesaria para permitir la actividad de trascripción de esta proteína11. Esta observación podría, en principio, explicar virtualmente todos los efectos que el 5-ASA induce sobre células de cáncer de colon, ya que la º-catenina ha sido implicada en el control molecular de las transiciones de ciclo celular G1/S12, 13 y G2/M14, 15 e indirectamente también de apoptosis. En esta patente presentamos los resultados de un conjunto de experimentos llevados a cabo sobre la línea celular de CRC CaCo2 y dirigidos a caracterizar mejor los mecanismos moleculares por los cuales el 5-ASA inhibe el mecanismo de señalización de º-catenina. Los resultados obtenidos demuestran claramente que este efecto está mediado, al menos en parte, por la inducción de una proteína llamada μ-protocaderina que pertenece a la superfamilia caderina y que es capaz de secuestrar º-catenina sobre la membrana plasmática de células de CRC tratadas con 5-ASA.

Efecto de la invención Por lo tanto, el objetivo de la presente invención está representado por un método in vitro o ex vivo para la determinación de la eficacia del 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC en un mamífero, preferiblemente un humano, posiblemente afectado por CRC, método que comprende medir la inhibición del mecanismo de ºcatenina y la activación de genes onco-supresores independientes en presencia del 5-ASA.

Más detalladamente, está representado por un método para la determinación de la eficacia del 5-ASA en la prevención y/o el tratamiento de CRC en un mamífero midiendo la expresión de al menos un gen implicado en la regulación del mecanismo de señalización de º-catenina y la expresión de otros genes onco-supresores.

Según una realización, el método comprende aislar dicho al menos un gen a partir de dicho mamífero y medir su expresión tanto en presencia como en ausencia de 5-ASA: si la expresión del gen es superior en presencia de 5-ASA que en ausencia del mismo, el 5-ASA será por tanto efectivo en la prevención y/o el tratamiento de CRC en dicho mamífero.

El gen que se usa para el método según la presente invención es μ-protocaderina.

La expresión génica puede medirse de acuerdo a los métodos disponibles habitualmente en la técnica, tales como QRT-PCR e inmunohistoquímica.

Resultados Análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real de genes que regulan el mecanismo de señalización de lcatenina en células de adenocarcinoma de colon CaCo2 expuestas a tratamiento con 5-ASA. Experimentos preliminares llevados a cabo en nuestro laboratorio confirmaron que el tratamiento con 5-ASA inhibe la actividad de proliferación de células CaCo2. Para investigar los mecanismos moleculares que subyacen bajo este efecto, llevamos a cabo un análisis de microsistemas, usando la metodología Affimetrix, con el objetivo de determinar los cambios de transcriptoma determinados sobre células CaCo2 mediante tratamiento con 5-ASA 20 mM durante 96 h. Los resultados obtenidos revelaron una expresión regulada al alza de una serie de genes onco-supresores, explicando potencialmente el efecto anti-proliferativo provocado por el 5-ASA, entre los cuales el más importante vino representado por μ-protocaderina. Este gen codifica para un miembro de la superfamilia caderina y, en base a informes previos de otros autores, aparece como un inhibidor putativo del mecanismo de señalización de º-catenina, es decir un mecanismo de proliferación celular mediado por la actividad del factor de transcripción de º-catenina16, 17. La relevancia de este descubrimiento reside en la observación de que el mecanismo de señalización de la catenina está activado constitutivamente en las CRC. Otros genes onco-supresores regulados al alza por el tratamiento con 5-ASA de las células analizadas estaban representados por los factores de transcripción KLF4 y CEBPa, implicados previamente en la inhibición de la proliferación de células tumorales epiteliales en general y de células CRC en particular18-20. Para validar estos datos, se analizaron los niveles de ARNm de los genes mencionados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) , en células CaCo2 tratadas con 5-ASA 20 mM durante 48 y 96 h. Adicionalmente, para caracterizar mejor el efecto funcional ejercido por el tratamiento investigado sobre el mecanismo de señalización de la º-catenina, también incluimos en este análisis otros genes que codifican para las siguientes proteínas: la propia º-catenina,... [Seguir leyendo]

20. Schuster MB, Porse BT. C/EBPalpha: a tumour suppressor in multiple tissues? Biochim Biophys Acta. Agosto 2006; 1766 (1) .

8. 103. Epub marzo 2006, 24. Revisión. PMID: 16616425 [PubMed - indexado para MEDLINE].

1. Un método in vitro o ex vivo para la determinación de la eficacia de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) en la prevención y/o el tratamiento de cáncer colorrectal en un mamífero, que comprende medir la inhibición del mecanismo de la º-catenina en presencia de 5-ASA, que se caracteriza por que comprende la medición de la expresión de μ-protocaderina.

2. El método según la reivindicación 1, que además comprende medir la expresión de los genes KLF4 y CEBPa.

3. El método según la reivindicación 1, que comprende aislar μ-protocaderina a partir de dicho mamífero y medir su expresión tanto en presencia como en ausencia de 5-ASA. 4. El método según la reivindicación 1, que se caracteriza por que la expresión de μ-protocaderina se mide

mediante QRT-PCR e inmunohistoquímica.

5. El método según la reivindicación 1, que se caracteriza por que dicho mamífero es un humano.

6. El método según la reivindicación 1, que se caracteriza por que dicho mamífero padece cáncer colorrectal.