Conservación de ARN y morfología en células y tejidos.

Una composición para la conservación y/o el almacenamiento de un tejido,

en donde el tejido comprende antígeno y ácido nucleico, para mantener la morfología para la histología, en donde la composición es una disolución no acuosa que comprende polietilenglicol (PEG) al 10-15% y metanol al 85-90%; en donde el PEG tiene un peso molecular menor de 600 daltons.

Conservación de ARN y morfología en células y tejidos

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición que contiene polietilenglicol (PEG) y metanol para la conservación de un tejido, especialmente a temperatura ambiente. También se puede utilizar para el almacenamiento de tejido. Un tejido conservado con y/o almacenado en las composiciones de la presente invención mantiene sus características morfológicas, el reconocimiento de sus antígenos por anticuerpos cognados, y la integridad de sus ácidos nucleicos (p. ej., ADN y ARN) sin necesidad de refrigeración o congelación.

2. Descripción de la técnica relacionada

El procesamiento citológico e histológico evita la autolisis de las células y los tejidos, respectivamente, después de su separación de un organismo vivo. Por otra parte, la estructura de las células individuales y su organización dentro del tejido se estabilizan por medio de tal tratamiento. Existe un requerimiento, sin embargo, de procedimientos sofisticados e instrumentos dedicados en la mayoría de los casos al procesamiento de células y tejidos en un entorno clínico. Por lo tanto, los especímenes se recogen normalmente en los consultorios médicos o salas quirúrgicas, y se transportan a un servicio de patología centralizado. Se necesitan composiciones adecuadas para la conservación y/o el almacenamiento de una célula o un tejido para asegurar que se evita la autolisis y que la morfología celular, los antígenos, y los ácidos nucleicos se mantienen hasta su procesamiento.

Además, el análisis genético es cada vez más importante por sí mismo o complementario a la tinción de células, análisis enzimáticos, y técnicas inmunológicas en patología. La expresión de los genes mutantes o la expresión en exceso de genes normales se pueden examinar mediante el análisis del ácido nucleico. La detección in situ del ARN puede localizar transcritos dentro de los tejidos que contienen diferentes tipos de células; esto también se puede lograr mediante la detección de ARN que ha sido extraído de diferentes porciones de células clasificadas o tejido seccionado. Se pueden observar mutaciones en el ADN o ARN. Se pueden utilizar análisis citológicos/histológicos y genéticos alternantes de células clasificadas o tejido seccionado para correlacionar eventos patológicos a niveles celulares y moleculares. El análisis genético solo será posible si se evita la degradación y se estabilizan las estructuras macromoleculares. Sin embargo, muchas composiciones conservantes y fijadores causan un daño irreversible (p. ej., actividad de las enzimas nucleasas ubicuas, hidrólisis de enlaces fosfodiéster y/o desamidación de bases) a la estructura de los ácidos nucleicos (p. ej., ADN, y especialmente ARN) y reducen su rendimiento, limitando de este modo la utilidad de las técnicas genéticas para el diagnóstico y las aplicaciones de investigación. Por consiguiente, la conservación de ácidos nucleicos en una célula o tejido frescos por lo general requiere una manipulación especial, tal como un procesamiento o congelación inmediatos, para permitir el examen por medio de una combinación de técnicas citológicas, histológicas, inmunológicas, y genéticas.

La composición descrita en la presente memoria se puede utilizar ventajosamente en el procesamiento de tejido convencional u otros métodos de procesamiento tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.207.408; el documento WO 01/44783; y el documento WO 01/44784. Las técnicas convencionales se describen en referencias generales tales como Thompson (Selected Histochemical and Histopathological Methods, Springfield, IL: Thomas, 1966) , Sheehan y Hrapchak (Theor y and Practice of Histotechnology, St. Louis, MO: Mosby, 1973) , Bancroft y Stevens (Theor y and Practice of Histological Techniques, Nueva York, NY: Churchill Livingstone, 1982) ; Boon & Kok (Microwave Cookbook of Pathology, Leiden, NL: Coulomb, 1989) ; Woods & Ellis (Laborator y Histopatology, Nueva York, NY: Churchill Livingstone, 1994) .

En las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.389.052; 3.546.334; 5.104.640; 5.256.571; 5.849.517; y 6.204.375; Florell et al. (Mod. Pathol., 14:116-128, 2001) ; Bostwick et al. (Arch. Pathol. Lab. Med., 118:298-302, 1994) ; Dimulescu et al. (Mol. Diagnosis, 3:67-71, 1998) ; Maxwell et al. (J. Clin. Pathol., 52:141-144, 1999) ; Shibutani et al. (Lab. Invest., 80:199-208, 2000) ; y Gillespie et al. (Am. J. Pathol., 160:449-457, 2002) se describen disoluciones conservante y fijadoras.

A. R. Warmington et al. (J. of Histotechnology 23 (4) , 12.2000, 299-308) describen composiciones para la conservación de tejidos que comprenden etanol al 60%, metanol al 20% y polietilenglicol al 7-20%. Una composición preferida comprende etanol al 60%, metanol al 20%, polietilenglicol a 7% y agua al 13%.

Las composiciones de la presente invención son novedosas y no obvias. Son disoluciones no acuosas que comprenden PEG y metanol, que conservan las características morfológicas, el reconocimiento de antígenos por anticuerpos cognados, y la integridad del ácido nucleico (p. ej., ADN y ARN) en tejido sólido sin el inconveniente de la refrigeración o la congelación del espécimen para evitar la degradación. De este modo, el tejido sólido se puede almacenar durante períodos prolongados a la temperatura ambiente. Las ventajas y mejoras adicionales debidas a la invención se comentan a continuación.

Compendio de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para la conservación y/o almacenamiento de tejidos. La composición contiene un polietilenglicol y metanol de acuerdo con la reivindicación 1. Es convenientemente una disolución no acuosa con un punto de fusión que está sustancialmente por debajo de la temperatura ambiente. Los tejidos pueden conservarse o almacenarse para la histología. Los antígenos o ácidos nucleicos del tejido se pueden analizar. La conservación de la morfología se puede evaluar con un microscopio. La conservación de antígenos y ácidos nucleicos se puede evaluar por medio del rendimiento de antígenos y ácidos nucleicos al menos parcialmente no degradados después de la extracción del tejido, o el incremento de la unión del anticuerpo y la hibridación de una sonda complementaria al tejido. También se proporcionan métodos para elaborar y utilizar la composición.

Otros objetos de la invención son un soporte para muestras y un recipiente a granel con la composición.

Un tejido conservado y/o almacenado de acuerdo con la invención se puede procesar adicionalmente para el análisis citológico, histológico, inmunológico, y/o genético. También se puede proporcionar una sección o bloque de tejido obtenidos después de la impregnación. El ácido nucleico (p. ej, , ADN o ARN) extraído de un tejido sólido conservado, almacenado, o procesado constituye otra realización de la invención.

Las realizaciones adicionales de la invención se describen con detalle a continuación o serán evidentes para el experto en la técnica a partir de la descripción de la presente memoria.

Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio en donde el ARN se ha separado en condiciones de desnaturalización. Después de incubar el tejido en diferentes composiciones durante tres días (Fig. 1A) o una semana (Fig. 1B) a aproximadamente 25°C, se extrajo el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN Trizol (Gibco BRL) . Cada muestra (A a F) se hizo circular en calles por duplicado (1 y 2) .

La Figura 2 muestra las secciones de tejido teñidas con hematoxilina-eosina. Los tejidos se incubaron en polietilenglicol 10% y metanol al 90% (Figs. 2A, 2C, 2E) o más tarde con ARN (Figs. 2B, 2D, 2F) durante 48 h (Figs. 2A-2B) , 72 h (Figs. 2C-2D) , o una semana (Figs. 2E-2F) a aproximadamente 25°C. Estos se procesaron, mediante el método convencional o de acuerdo con el método descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.207.408, y después se tiñeron. El aumento es de 400 x (Figs. 2A-2F) .

Descripción de las realizaciones específicas de la invención Las composiciones descritas en la presente memoria se desarrollaron por su simplicidad química, capacidad para conservar las características morfológicas y genéticas de los tejidos, y la conveniencia y practicidad de uso a temperatura ambiente. Un tejido se puede almacenar en las mismas y servir como una fuente de archivo para análisis citológicos, histológicos, y/o genéticos. Se puede conservar y/o almacenar para un estudio prospectivo o retrospectivo. Aunque no se prefiere, el almacenamiento en la composición de la presente invención también... [Seguir leyendo]

1. Una composición para la conservación y/o el almacenamiento de un tejido, en donde el tejido comprende antígeno y ácido nucleico, para mantener la morfología para la histología, en donde la composición es una disolución no acuosa que comprende polietilenglicol (PEG) al 10-15% y metanol a.

8. 90%; en donde el PEG tiene un peso molecular menor de 600 daltons.

2. La composición de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la disolución no acuosa consiste en polietilenglicol (PEG) al 10-15% y metanol a.

8. 90%.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la disolución no acuosa comprende polietilenglicol (PEG) a aproximadamente 10% y metanol a aproximadamente 90%.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la disolución no acuosa consiste en polietilenglicol (PEG) a aproximadamente 10% y metanol a aproximadamente 90%.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el PEG tiene un peso molecular de 400 daltons o menos.

6. El uso de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para conservar y/o almacenar al menos un tejido.

7. Un método para elaborar la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende mezclar PEG y metanol.

8. Un soporte de tejido que contiene la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y adaptado para contener al menos un tejido.

9. Un método de conservación de un tejido que comprende poner en contacto al menos el tejido con la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Un método de almacenamiento de tejido que comprende poner en contacto tejido conservado al menos parcialmente con la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

11. Un método de procesamiento de tejido conservado y/o almacenado utilizando la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para el análisis genético que comprende extraer ácido nucleico de al menos una porción del tejido.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico es ARN.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico es ADN.

14. Un método de procesamiento de tejido conservado y/o almacenado con la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para análisis inmunológico que comprende extraer antígeno de al menos una porción del tejido.