Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína.

Método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero,

en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS), comprendiendo el método introducir al menos un grupo funcional A, en el que A es un grupo carboxilo reactivo, en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para dar el grupo carboxilo reactivo A, y hacer reaccionar al menos un grupo funcional A del derivado de polímero con al menos un grupo funcional Z de la proteína y formar de ese modo un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína La presente invención se refiere a conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína estando formados estos conjugados por un enlace covalente entre el hidroxialquilalmidón o un derivado del hidroxialquilalmidón y la proteína. La presente invención también se refiere al método de producción de estos conjugados y al uso de estos conjugados.

Se acepta generalmente que la estabilidad de proteínas puede mejorarse y la respuesta inmunitaria contra estas proteínas se reduce cuando estas proteínas se acoplan a moléculas poliméricas. El documento WO 94/28024 da a conocer que proteínas fisiológicamente activas modificadas con polietilenglicol (PEG) presentan inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más tiempo que proteínas no conjugadas, es decir, tienen una tasa de aclaramiento reducida.

El documento WO 02/09766 da a conocer, entre otros, compuestos de proteína-polímero biocompatibles que se producen mediante conjugación de una proteína biológicamente activa con un derivado de polímero biocompatible. Los polímeros biocompatibles usados son polímeros ramificados altamente reactivos, y los conjugados resultantes contienen un ligador largo entre el derivado de polímero y la proteína. Como polímeros biocompatibles, se describen polímeros de fórmula (P-OCH2CO-NH-CHR-CO-) n-L-Qk-A, en la que P y Q son residuos poliméricos y k puede ser 1 ó 0. Para P y Q, se mencionan polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxietileno, politrimetilenglicol, poli (ácido láctico) y sus derivados, poli (ácido acrílico) y sus derivados, poliaminoácido, poli (alcohol vinílico) , poliuretano, polifosfazeno, poli (L-lisina) , poli (óxido de alquileno) , poliacrilamida y polímeros solubles en agua tales como dextrano o polisacárido. Como proteínas, entre otras, se mencionan interferones alfa, beta y gamma, factores sanguíneos, citocinas tales como interleucinas, G-CSF, GM-CSF. En los ejemplos del documento WO 02/09766, sólo se dan a conocer derivados de mono-, di- y tri-polietilenglicol que están acoplados exclusivamente a interferón y factor de crecimiento epidérmico, y hormona de crecimiento humana.

El documento WO 94/01483 da a conocer conjugados de polímeros biocompatibles que se forman uniendo covalentemente un polímero biológicamente inactivo o derivado de polímero con un polímero hidrófilo sintético, farmacéuticamente puro por medio de tipos específicos de enlaces químicos. Como polímeros que se producen de manera natural y derivados de los mismos, se dan a conocer polisacáridos tales como ácido hialurónico, proteoglucanos tales como sulfatos de condroitina A, B y C, quitina, heparina, sulfato de heparina, dextranos tales como ciclodextrano, hidroxietilcelulosa, éter de celulosa y almidón, lípidos tales como triglicéridos y fosfolípidos. Como polímeros sintéticos, entre otros, se describe que el polietileno y los derivados del mismo tienen un peso molecular promedio de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 100.000. Como proteínas unidas al polímero o el derivado de polímero, se describen citocinas y factores de crecimiento, incluyendo interferones, factores de necrosis tumoral, interleucinas, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento tales como extracto de factor osteogénico, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento de fibroblastos ácido y otros se dan a conocer. En todos los ejemplos de trabajo del documento WO 94/01483, se usan derivados de polietilenglicoles como polímero.

El documento WO 96/11953 da a conocer compuestos proteicos modificados químicamente en el extremo Nterminal y métodos de su producción. Específicamente, se describen composiciones de G-CSF que resultan del acoplamiento de un polímero soluble en agua con el extremo N-terminal de G-CSF. En el contexto del documento WO 96/11953, también se da a conocer interferones consenso acoplados en el extremo N-terminal a polímeros solubles en agua. Aunque se enumera una amplia variedad de polímeros solubles en agua en el documento WO 96/11953 (por ejemplo copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli (alcohol vinílico) , polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o bien copolímeros al azar) , poli (n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de poli (óxido de propileno) /óxido de etileno o polioles polioxietilados) , sólo se describen composiciones de IFN consenso o G-CSF pegilado en los ejemplos de trabajo del documento WO 96/11953.

El documento WO 97/30148 se refiere a conjugados de polipéptido con alergenicidad reducida que comprenden una molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas de polipéptido acopladas a la misma. Estos conjugados son preferiblemente parte de composiciones usadas en el mercado del cuidado personal. Dichos conjugados se producen activando una molécula portadora polimérica, haciendo reaccionar dos o más moléculas de polipéptido con la molécula portadora polimérica activada y bloqueando grupos activos residuales en el conjugado. Como molécula portadora polimérica, se enumera una gran variedad en el documento WO 97/30148, incluyendo diferentes grupos de compuestos tales como homopolímeros naturales o sintéticos tales como polioles, poliaminas, poli (ácidos carboxílicos) y heteropolímeros que comprenden al menos dos grupos de unión diferentes. Se proporcionan ejemplos que comprenden PEG en estrella, PEG ramificados, poli (alcoholes vinílicos) , policarboxilatos, polivinilpirrolidonas y poli-D, L-aminoácidos. Entre otros, se dan a conocer también dextranos tales como carboximetildextrano, celulosas tales como hidroxietilcelulosa o hidroxipropilcelulosa, hidrolizados de quitosano, almidones tales como hidroxietilalmidones o hidroxipropilalmidones, glucógeno, agarosa, goma guar, inulina, pululano, goma xantana, carragenanos, pectina, ácido algínico. Como polipéptidos, sólo se dan a conocer algunas enzimas explícitamente.

Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron, vol. 27 (1981) , págs. 1723-1726 describen la modificación química de dextrano e hidroxietilalmidón para dar polímeros sustituidos con aldehído que se dejan reaccionar con hemoglobina para dar hemoglobinas unidas a polímeros solubles. Se mostró que éstas podían unirse a oxígeno, pero experimentos de perfusión cardiaca indicaron claramente que las hemoglobinas unidas a polímeros no eran adecuadas para su uso como sustitutos sanguíneos.

El documento WO 99/49897 describe conjugados de hemoglobina formados haciendo reaccionar polisacáridos tales como dextrano o hidroxietilalmidón con grupos amino de la hemoglobina. Como grupos funcionales del polisacárido, se usan grupos aldehído producidos mediante apertura oxidativa del anillo de sacárido. Como agente reductor preferido usado, se da a conocer borano-dimetilamina. Además, el documento WO 99/49897 se limita exclusivamente a hemoglobina.

El documento WO 03/074087 se refiere a un método de acoplamiento de proteínas a un polisacárido modificado derivado de almidón. La acción de unión entre la proteína y el polisacárido, hidroxialquilalmidón, es un enlace covalente que se forma entre el grupo aldehído terminal o un grupo funcional que resulta de la modificación química de dicho grupo aldehído terminal de la molécula de hidroxialquilalmidón, y un grupo funcional de la proteína. Como grupo reactivo de la proteína, se dan a conocer grupos amino, grupos tio y grupos carboxilo, y no se mencionan grupos aldehído de la proteína. Además, aunque se proporciona una gran variedad de posibilidades de diferentes enlaces en forma de muchas listas, incluyendo diferentes grupos funcionales, diferentes moléculas de ligador teóricamente adecuadas y diferentes procedimientos químicos, los ejemplos de trabajo describen sólo dos alternativas: en primer lugar, se usa un hidroxietilalmidón oxidado y se acopla directamente a proteínas usando activación con etildimetilaminopropilcarbodiimida (EDC) , o se usa un hidroxietilalmidón no oxidado y se acopla directamente a una proteína que forma una base de Schiff que posteriormente se reduce para dar la amina respectiva. Por tanto, los ejemplos de trabajo del documento WO 03/074087 no dan a conocer un único conjugado acoplado mediante un grupo tio o un grupo carboxilo a la proteína, ni describen un conjugado que comprende hidroxietilalmidón, la proteína, y una o más moléculas de ligador.

El documento WO 02/080979 se refiere a conjugados de hidroxialquilalmidón y un agente activo, estando... [Seguir leyendo]

1. Método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero, en el que el polímero es un hidroxialquilalmidón (HAS) , comprendiendo el método introducir al menos un grupo funcional A, en el

que A es un grupo carboxilo reactivo, en el polímero para dar un derivado de polímero haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con un diéster carbónico para dar el grupo carboxilo reactivo A, y hacer reaccionar al menos un grupo funcional A del derivado de polímero con al menos un grupo funcional Z de la proteína y formar de ese modo un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el hidroxietilalmidón tiene un peso molecular de desde 2 hasta 15 200 kD, preferiblemente de desde 4 hasta 130 kD, más preferiblemente de desde 4 hasta 70 kD.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el diéster carbónico es un diéster simétrico.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente de alcohol del éster se selecciona del grupo que consiste en N-hidroxisuccinimida, N-hidroxisuccinimida sulfonatada, Nhidroxibenzotriazol y fenoles sustituidos con nitro y halógeno.

6. Método según la reivindicación 5, en el que los fenoles sustituidos con nitro y halógeno se seleccionan del 25 grupo que consiste en nitrofenol, dinitrofenol, triclorofenol, trifluorofenol, pentaclorofenol y pentafluorofenol.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la reacción del al menos un grupo hidroxilo del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado con el diéster carbónico para dar un grupo éster reactivo A se lleva a cabo en un disolvente polar aprótico anhidro.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el disolvente es dimetilacetamida, dimetilformamida o una mezcla de las mismas.

9. Conjugado tal como puede obtenerse mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 35

10. Conjugado según la reivindicación 9, en el que A es un grupo carboxilo reactivo, y en el que A se introdujo en el polímero cuyo extremo reductor no estaba oxidado, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del polímero con un diéster carbónico, y en el que dicho conjugado que comprende una molécula de polímero y al menos una, en particular de desde 1 hasta 10 moléculas de proteína unidas al polímero mediante enlaces amida, y en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM-CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX.

11. Conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, en el que el polímero es

un hidroxialquilalmidón (HAS) y la proteína se selecciona del grupo que consiste en IFN alfa, IFN beta, GM45 CSF, APC, tPA, A1AT, AT III, factor VII, factor VIII y factor IX, que tiene una estructura según la fórmula en la que el enlace -O- (C=O) - se formó mediante una reacción de un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo con un grupo hidroxilo de la molécula de HAS, y en la que HAS’’ se refiere a la molécula de HAS sin dicho grupo hidroxilo.

12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

13. Composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente eficaz un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende además al menos un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es IFN alfa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia por ejemplo tricoleucemia, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis, por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica.

16. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es IFN beta, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente formas recidivantes de esclerosis múltiple.

17. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es GM-CSF, para la preparación de un medicamento para la reconstitución mieloide tras trasplante de médula ósea o quimioterapia de inducción en adultos más ancianos con leucemia mielógena aguda, fallo o retraso del injerto de trasplante de médula ósea, movilización y tras trasplante de células progenitoras de sangre periférica autólogas.

18. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es APC, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de septicemia grave, trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

19. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es tPA, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infartos de miocardio (ataques al corazón) , trombosis, tromboembolia o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.

20. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es A1AT, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfisema, fibrosis quística, dermatitis atópica y/o bronquitis.

21. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es AT III, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de deficiencia hereditaria, enfermedad venooclusiva, quemaduras y resistencia a la heparina en cirugía de injerto de derivación arterial coronaria (CABG) , la prevención de la formación de microcoágulos asociada con terapia de ventilación, el tratamiento de perforación intestinal que resulta de traumatismo o cirugía gastrointestinal; coagulación intravascular diseminada (DIC) y/o septicemia.

22. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor VII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para el factor VIII o el factor IX.

23. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor VIII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A.

24. Uso de un conjugado de HAS-proteína, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la proteína es factor IX, para la preparación de un medicamento para el control y la prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B, preferiblemente deficiencia de factor IX congénita o enfermedad de Christmas, incluyendo el control y la prevención de hemorragia en entornos quirúrgicos.