Conducto para nervios multicanal de colágeno para la reparación de nervios.

Un procedimiento de fabricación de un conducto para nervios multicanal de colágeno que comprende:

(a) colocar al menos una matriz alargada entre dos retenedores de un molde de conducto para nerviosmulticanal, de tal manera que las matrices se mantengan en una relación separada entre sí,

(b) verter la disolución de colágeno sobre cada matriz para que toda la matriz quede sustancialmente recubierta,

(c) secar la disolución de colágeno en las matrices,

(d) repetir las etapas (a) a (c) con más matrices hasta que se hayan usado tantas matrices como el número decanales deseados en el conducto,

(e) reticular el colágeno seco en las matrices, y

(f) lavar el colágeno reticulado en las matrices para retirar la disolución de reticulación residual.

Conducto para nervios multicanal de colágeno para la reparación de nervios La presente invención se refiere a la fabricación de conductos para nervios multicanales para su uso en la reparación de lesiones de nervios. En particular, la invención se refiere a conductos para nervios multicanales de colágeno que son adecuados para su uso en la reparación de los nervios periféricos.

Antecedentes de la invención Las lesiones de los nervios periféricos pueden producirse por traumatismos y por lesión iatrogénica. Cada año, en los EE.UU. y en Europa se producen más de 700.000 lesiones de nervios periféricos como consecuencia de traumatismos accidentales y durante las cirugías. En la mayoría de las lesiones los extremos de los nervios no pueden ponerse uno frente al otro. Actualmente existen dos opciones para la reparación en esta situación. A pesar de que un injerto autólogo de nervio es el estándar de referencia en la reparación de nervios por medio de injerto, tiene varias desventajas, incluyendo la necesidad de realizar una nueva incisión, la pérdida de la función del nervio donante, la falta de coincidencia de tamaños entre el nervio donante y el nervio lesionado y una limitada disponibilidad de nervios donantes. La segunda alternativa prometedora es utilizar un "tubo para nervios" sintético como un conducto para la regeneración. Una diversidad de biopolímeros sintéticos y naturales, tales como el ácido poliglicólico, el ácido poliláctico, el quitosano, el alginato de seda y sus compuestos o derivados, han mostrado niveles variables de éxito y defectos [Jiao y col., 2009; Yang y col., 2007; Matsmoto y col., 2000; Evans y col., 2002; Toba y col., 2002; Thomas y col., 2005; Wang y col., 2005; Bellamkonda, 2006; Jiang y col., 2007].

La matriz de tejido nervioso está compuesta de tubos de lámina basal que rodean a la unidad axón-célula de Schwann y fibrillas de colágeno orientadas longitudinalmente. Existen amplias y convincentes pruebas de que el éxito de la regeneración nerviosa periférica depende de la matriz extracelular [Giannini y col., 1990; Sorenson y col., 1993]. El colágeno, el principal componente estructural de estas estructuras, es una molécula de matriz extracelular (ECM) que puede tener ventajas específicas sobre otros polímeros sintéticos y naturales, ya que posee dominios de adhesión y de señalización celular que son fundamentales para la regeneración del nervio. Como el colágeno puede presentar un microentorno biológico altamente relevante para el crecimiento axonal, se han desarrollado una variedad de conductos de colágeno para estudios de regeneración de nervios [Archibald y col., 1991; Collin y col., 1984; Laquerriere y col., 1993].

Los estudios previos sobre regeneración de nervios se han realizado predominantemente en base a conductos de un solo canal [Jiao y col., 2009; Yang y col., 2007; Matsmoto y col., 2000; Evans y col., 2002; Toba y col., 2002; Thomas y col., 2005; Wang y col., 2005; Bellamkonda y col., 2006; Jiang y col., 2007]. Se han investigado estructuras fibrosas y microranuras y se han introducido en el diseño de los conductos para nervios para mejorar la orientación del crecimiento axonal [Chew y col., 2007; Yang y col., 2008; Kim y col., 2007; Yao y col., 2009 1, 2]. Sin embargo, independientemente de la microtopografía de la superficie, la reparación con tubos para nervios de un solo canal puede dar lugar a una reinervación inadecuada de la diana debida a la dispersión de los axones de regeneración a través del injerto. [Brushart y col., 1995; de Ruiter y col., 2008b]. Aunque un estudio previo sobre reparación de nervios basado en conductos multicanal de PLGA indicó una menor dispersión axonal en comparación con el conducto de un solo canal, la mayoría de los conductos de PLGA se hincharon y se colapsaron en el plazo experimental (de Ruiter G y col., 2008b) .

Los conductos multicanal de colágeno que se asemejan a la estructura de los tubos múltiples de la lámina basal de los nervios pueden limitar la dispersión de la regeneración de los axones y proporcionar orientación para el crecimiento del nervio. Al fabricar la próxima generación de conductos para nervios, es necesario tener presentes varios aspectos. Estos incluyen la biocompatibilidad de los materiales, y las propiedades mecánicas y de degradación personalizadas. Los conductos de colágeno de un solo canal que poseen resistencia mecánica y son fáciles de procesar han sido utilizados previamente en aplicaciones para la regeneración de nervios. Debido a que los canales de los conductos multicanal de colágeno son mucho más pequeños que los conductos de un solo canal, una leve hinchazón y deformación puede reducir significativamente las cavidades de los canales e impedir el crecimiento de los nervios. La fabricación de conductos multicanal de colágeno es muy exigente y necesita una buena programación y optimización.

Una serie de conductos para nervios están autorizados por la FDA para defectos nerviosos relativamente cortos, como el tubo de colágeno Tipo I de Integra Neurosciences, NeuraGen™, neuroflex de Collagen Matrix Inc. y Neurptube™ de Synovis Surgical Innovations. Estos son tubos de un solo canal que se usan únicamente para pequeños defectos de varios milímetros y no abordan lesiones más grandes de nervios periféricos. Además, los axones que se regeneran a través de estos tubos de un solo lumen asumen una dirección dispersa, lo que da como resultado una reinervación inapropiada de la diana y la contracción simultánea de los músculos opuestos o sincinesia. La ventaja de los conductos para nervios multicanal es que la dispersión puede ser limitada ya que se asemejan a la estructura de tubos múltiples de la lámina basal de los nervios.

El objetivo del presente estudio fue desarrollar un conducto para nervios robusto a base de colágeno con múltiples canales de diámetro inferior al milímetro y dimensionalmente estables para facilitar la orientación del nervio y limitar

la dispersión. Con este objetivo, los autores han desarrollado una innovadora técnica de moldeo de múltiples etapas (secuencial) para crear conductos de 1, 4 y 7 canales a partir de una disolución con alta concentración de colágeno. Los conductos se reticularon con (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) en N-hidroxisuccinimida (NHS) ) para controlar la velocidad de biodegradación y para limitar la hinchazón.

Para examinar la biocompatibilidad del colágeno reticulado, se cultivaron ganglios de la raíz dorsal en los sustratos y se cuantificó el crecimiento axonal. Puesto que la robustez mecánica y la capacidad de retroceso elástico de los conductos son esenciales para la implantación y el éxito posquirúrgico, las propiedades mecánicas estructurales se caracterizaron por medio de pruebas de tracción, compresión y flexión de tres puntos. Esta combinación de análisis químicos, biológicos y mecánicos es necesaria para determinar el diseño óptimo del biomaterial para los estudios de implantación.

Los conductos se implantaron en un defecto de 1 cm del nervio ciático de la rata y la regeneración nerviosa se evaluó mediante el uso de registros del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) , morfometría cuantitativa del nervio y estudios de marcaje axonal retrógrado simultáneo.

De Ruiter, y col. (Journal of Biomedical Materials Research, 2008, pág. 643-651) describen un conducto para nervios de múltiples canales fabricado de un polímero de ácido láctico y glicólico (PLGA) sintético que se fabrica por medio de una técnica de moldeo por inyección y evaporación de disolvente. La patente de EE.UU. Nº 5019087 da a conocer un procedimiento de hilado de una mezcla de colágeno y laminina sobre un mandril para producir un conducto para nervios de un solo canal.

Objeto de la invención Es un objeto de la presente invención proporcionar un conducto para nervios adecuado para la reparación de nervios periféricos. Otro objeto de la invención es proporcionar un andamiaje de biomaterial con propiedades materiales y mecánicas favorables. Otro objeto es proporcionar un conducto para nervios multicanal de colágeno con mínimas propiedades de hinchazón y deformación. Otro objeto es proporcionar conductos para nervios que puedan adaptarse para incorporar biomoléculas terapéuticas. Otros objetos más son proporcionar conductos con baja toxicidad para el tejido circundante, y que sean biocompatibles y biodegradables, y que además promuevan el crecimiento de los nervios de una manera regular y controlada. Otro objeto es proporcionar un conducto para nervios con una resistencia mecánica alta.

Resumen de la invención Según la presente invención, se proporciona un procedimiento de fabricación de un conducto... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de fabricación de un conducto para nervios multicanal de colágeno que comprende:

(a) colocar al menos una matriz alargada entre dos retenedores de un molde de conducto para nervios multicanal, de tal manera que las matrices se mantengan en una relación separada entre sí,

(b) verter la disolución de colágeno sobre cada matriz para que toda la matriz quede sustancialmente recubierta,

(c) secar la disolución de colágeno en las matrices,

(d) repetir las etapas (a) a (c) con más matrices hasta que se hayan usado tantas matrices como el número de canales deseados en el conducto,

(e) reticular el colágeno seco en las matrices, y

(f) lavar el colágeno reticulado en las matrices para retirar la disolución de reticulación residual.

2. Un procedimiento de fabricación de un conducto para nervios multicanal de colágeno que comprende:

(a) fijar al menos una matriz alargada entre dos retenedores separados,

(b) verter la disolución de colágeno sobre la matriz para que toda la matriz quede sustancialmente recubierta,

(c) dejar secar la disolución de colágeno en la matriz,

(d) reticular el colágeno seco en la matriz,

(e) lavar el colágeno reticulado en la matriz para eliminar el agente de reticulación.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2 en el que se vierte más disolución de colágeno alrededor de la construcción de colágeno seca en la matriz y/o vertida alrededor del retenedor.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de colágeno es de entre 3 y 15 mg/ml, de preferencia 12 mg/ml.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de reticulación está seleccionado del grupo que consiste en EDC, transglutaminasa, glutaraldehído, genepin, sulfonatos, incluidos el sulfonato de metilo y sulfonato de trifluorometilo, malemida, sistemas dendriméricos de polietilenglicol tales com.

4. StarPEG, polímeros dendríticos, polímeros dendríticos hiper-ramificados, formaldehído, agentes de reticulación enzimáticos, glicación, gliceraldehídos, cianamida, diimida, diisocianato, adipimidato de dimetilo, carbodiimida y epoxi.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el colágeno secado al aire es reticulado con una disolución de EDC 1-60 mM y NHS 1-30 mM en disolución de MES 1-100 mM, de preferencia EDC 30 mM y NHS 10 mM en disolución de MES 50 mM.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de lavado se lleva a cabo con NaH2PO4 0, 1-0, 2 M y agua destilada.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que después del lavado, el colágeno es liofilizado sobre la matriz.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el conducto para nervios de colágeno es retirado de la matriz.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la matriz es un alambre de metal.

11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se utilizan de dos a doscientos, de preferencia dos, cuatro o siete matrices entre los retenedores.

12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las matrices son de tamaño uniforme y están separadas de manera uniforme.

13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el colágeno es colágeno tipo I, de preferencia colágeno de tendón de bovino.

14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende la inmovilización de biomoléculas al colágeno, de preferencia seleccionadas del grupo que comprende ácidos nucleicos tales como ADN de plásmido o siARN, péptidos, laminina o factores de crecimiento nervioso tales como NGF o NT3.

15. Un conducto para nervios multicanal de colágeno reticulado cuando esté producido por un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.