Composiciones de vacuna basadas en inmunógenos modificados de gp41.

Composiciones de vacuna basadas en inmunógenos modificados de gp41.

La invención se refiere a inmunógenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que se basan en epítopos de gp41 localizados en la región extracelular proximal de membrana (MPER). Los inmunógenos de la presente invención son capaces de inducir la actividad neutralizante del suero. Se divulgan y ejemplifican varias formas de estos inmunógenos aislados. Las moléculas aisladas de ácido nucleico que expresan partes relevantes de estos inmunógenos, así como los vectores y células huésped utilizados para su producción, también están dentro del ámbito de la invención.

Composiciones de vacuna basadas en inmunógenos modificados de gp41

Campo de la invención La presente invención se refiere a inmunógenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , basados en epítopos de gp41 localizados en la región extracelular proximal de membrana (MPER) . Los inmunógenos de la presente invención son capaces de inducir la expresión de anticuerpos neutralizantes. Se divulgan y ejemplifican varias formas de estos inmunógenos aislados. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que expresan partes relevantes de estos inmunógenos, así como los vectores y células huéspedes utilizados para su producción, también están dentro del ámbito de la presente invención.

Antecedentes de la invención Se estima que más de 60 millones de personas en el mundo se han infectado con el virus de la inmunodeficiencia humana desde 1982. Casi la mitad de estos individuos infectados han muerto del síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA) resultante en el mismo intervalo de tiempo. Aunque la propagación del virus parece haber alcanzado una meseta últimamente, se describieron 2, 7 millones de nuevas infecciones por VIH en 2007. El VIH aún es un problema de salud pública principal. Véase, UNAIDS, 2008 Report on the Global AIDS Epidemic.

El VIH actúa dirigiéndose e infectando células T CD4+. Por estos medios el VIH inhabilita un mecanismo de respuesta inmune principal contra no solo la infección de VIH, sino también otras enfermedades oportunistas. Véase, Dalgleish A, et al., Nature 1984; 312:767-768; Maddon F, et al., Cell 1986; 47:333-348; McDougall J, et al., Science 1986; 231:382-385.

La infección de células T CD4+ por VIH se caracteriza por la fusión de la membrana vírica del VIH y la membrana celular diana. Este proceso está catalizado por la glicoproteína de la envuelta (env) gp160. La gp160 madura está compuesta de dos subunidades asociadas de forma no covalente, las proteínas gp120 de superficie y gp41 transmembrana. Véase, Wyatt R, Sodroski J, Science 1998; 280:1884-1888.

La parte extracelular de la proteína gp41 contiene tres regiones funcionales esenciales: un péptido de fusión (FP) , una repetición héptada N-terminal (NHR) y una repetición héptada C-terminal (CHR) . Las regiones NHR y CHR contienen un número de motivos similares a cremallera de leucina que tienen tendencia de formar estructuras helicoidales. Véase, Peisajovich S, Shai Y, Biochem. Biophys. Acta 2003; 1614:122-129; Suarez T, et al., FEBS Lett. 2000; 477:145-149; Chan D, et al., Cell 1997; 89:263-273. Las estructuras helicoidales de gp41 protegen varios de sus epítopos previniendo de esta manera la expresión de anticuerpos contra los antígenos protegidos.

Debido a su importancia en el ciclo de replicación de VIH, se han propuesto muchas estrategias terapéuticas basadas en diferentes formas de inhibición de gp41. Por ejemplo, se ha encontrado que péptidos derivados de NHR y CHR son eficaces en la inhibición de la fusión de VIH-1 con las células diana. Véase, Bolognesi D, et al., US 5.464.933; Bolognesi D, et al., US 6.133.418; Barney S, et al., US 6.093.794; Jiang S, et al., US 5.840.843. En 2003 la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos licenció un péptido de CHR, enfuvirtida, como el primer miembro de una nueva clase de fármacos anti-VIH inhibidores de fusión.

Sin embargo, una de las principales limitaciones en el desarrollo de vacunas contra el VIH es el diseño de inmunógenos capaces de provocar anticuerpos neutralizantes amplios. El diseño de estos inmunógenos requiere, en primer lugar, la identificación de epítopos conservados para asegurar una respuesta continua y estable y, en segundo lugar, idear inmunógenos nuevos y más eficaces que presenten adecuadamente esos epítopos.

También se ha propuesto el uso de anticuerpos neutralizantes contra la glicoproteína de la envuelta y sus subunidades para prevenir la replicación de VIH. Véase, Yang X, et al., J. Virol. 2005; 79:3500-3508. En la técnica se han descrito anticuerpos contra epítopos de gp41 o proteínas de fusión que contienen secuencias de gp41. Véase, Quinnan G, et al., WO2006/026508; Cherkasky A, WO2006/136892.

Sin embargo, hay aún una necesidad en la técnica para inmunógenos mejores que podrían inducir la expresión de anticuerpos específicos contra la proteína gp41 y reducir por tanto la probabilidad de una infección por VIH.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a diferentes inmunógenos de gp41 con poder inmunogénico aumentado. Estos inmunógenos se caracterizan por la eliminación de una o más regiones inmunodominantes, como las regiones

HR1 y bucle, de gp41. Este planteamiento ha incrementado la idoneidad de los inmunógenos a ambientes lipídicos y aumentado su reconocimiento por anticuerpos neutralizantes.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las variantes de gp41, a vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y a células huéspedes que comprenden los ácidos nucleicos y vectores indicados anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden el polipéptido, las secuencias de ácido nucleico, las células huéspedes que comprenden los ácidos nucleicos y vectores de las invenciones o combinaciones de las mismas. Una forma de realización adicional de la presente invención se refiere al uso de estas composiciones farmacéuticas como medicamentos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la detección de anticuerpos anti-gp41 en una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con un polipéptido de la invención en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre los anticuerpos en la muestra y el polipéptido y detectar la formación de dicho complejo.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método para optimizar la producción de los polipéptidos de la invención que comprende incubar las células huéspedes que expresan el polipéptido con butirato de sodio y ácido mirístico.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Respuesta inmune a regiones de gp41. La altura de las columnas, que muestran todos los anticuerpos identificados, sirve como medida de la inmunogenicidad. Las diferentes regiones de gp41 se indican en código de color. A: región inmunodominante. B: región poco inmunogénica.

Figura 2. Colección de inmunógenos de gp41 sin etiqueta.

Figura 3. Regiones de gp41 utilizadas en el diseño de cebadores. Las regiones se muestran en sentido 5’ a 3’ e incluyen secuencias solapantes para la generación de proteínas fusionadas.

Figura 4. Diagrama del plásmido GP41-MIN y plegamiento proteico esperado.

Figura 5. Diagrama del plásmido GP41-MINFULL y plegamiento proteico esperado.

Figura 6. Diagrama del plásmido GP41-STAPLE y plegamiento proteico esperado.

Figura 7. Diagrama del plásmido GP41-STAPLEFULL y plegamiento proteico esperado.

Figura 8. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-MIN en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 4E10 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 9. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-MIN en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 2F5 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 10. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-MINFULL en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 4E10 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 11. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-MINFULL en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 2F5 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 12. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-STAPLE en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 4E10 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 13. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-STAPLE en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 2F5 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 14. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-STAPLEFULL en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 4E10 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura 15. Expresión de superficie de los inmunógenos GP41-STAPLEFULL en células HEK-293T probadas mediante anticuerpos anti-gp41 2F5 en un ensayo de citometría de flujo 48 horas después de la transfección.

Figura... [Seguir leyendo]

1. Una variante polipeptídica de gp41 de VIH que carece de al menos una de las regiones inmunodominantes en el dominio extracelular.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1 en donde la región inmunodominante se selecciona del grupo que consiste en la repetición héptada 1, la región bucle y la región que comprende el repetición héptada 1 y la región bucle.

3. Un polipéptido según las reivindicaciones 1 o 2 que comprende del extremo N-terminal-al C-terminal

(i) la repetición héptada 2 de gp41 de VIH o una variante inmunológicamente equivalente de la misma,

(ii) la región externa proximal de membrana de gp41 de VIH o una variante inmunológicamente equivalente de la misma y

(iii) la región transmembrana de gp41 de VIH o una variante inmunológicamente equivalente de la misma.

4. Un polipéptido según la reivindicación 3 en donde el polipéptido comprende además la región intracelular de gp41 de VIH o una variante inmunológicamente equivalente de la misma en donde el extremo Nterminal terminal de dicha región intracelular de gp41 de VIH o de la variante inmunológicamente equivalente de la misma está unida al extremo C de la región transmembrana de gp41 de VIH o la variante inmunológicamente equivalente de la misma.

5. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4 en donde el polipéptido comprende además el péptido de fusión de gp41 de VIH o una variante inmunológicamente equivalente del mismo en donde el extremo C de dicho péptido de fusión o de la variante inmunológicamente equivalente del mismo está unido al extremo N-terminal de la repetición héptada 2 de gp41 de VIH o de la variante inmunológicamente funcional de la misma.

6. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la repetición héptada 2 de gp41 de VIH comprende los aminoácidos 623 a 664 de la secuencia de SEQ ID NO: 6, la región proximal de membrana de gp41 de VIH comprende los aminoácidos 665 a 682 de la secuencia de SEQ ID NO: 6, la región transmembrana de gp41 de VIH comprende los aminoácidos 683 a 705 de la secuencia de SEQ ID NO: 6, la región intracelular de gp41 de VIH comprende los aminoácidos 706 a 856 de la secuencia de SEQ ID NO: 6 y/o el péptido de fusión de gp41 de VIH comprende los aminoácido.

51. 532 de la secuencia de SEQ ID NO: 6.

7. Un polipéptido según la reivindicación 6 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-18.

8. Un polinucleótido que codifica un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un polinucleótido según la reivindicación 8 en donde el polinucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 a 30.

10. Un vector que comprende un polinucleótido como se ha definido en las reivindicaciones 8 o 9.

11. Una célula huésped que comprende un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido como se ha definido en las reivindicaciones 8 o 9 o un vector como se ha definido en la reivindicación 10.

12. Una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénicamente activa de un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido como se ha definido en las reivindicaciones 8 o 9, un vector como se ha definido en la reivindicación 10 o una célula huésped como se ha definido en la reivindicación 11.

13. Un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido como se ha definido en las reivindicaciones 8 o 9, un vector como se ha definido en la reivindicación 10 o una célula huésped como se ha definido en la reivindicación 11 para su uso en medicina.

14. Un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido como se ha definido en las reivindicaciones 8 o 9, un vector como se ha definido en la reivindicación 10 o una célula huésped como se ha definido en la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de una infección por VIH.

15. Un método para la detección de anticuerpos anti-gp41 en una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre los anticuerpos en la muestra y el polipéptido y detectar la formación de dicho complejo.

16. Un método para optimizar la producción del polipéptido de la reivindicación 1, que comprende incubar las células huéspedes que expresan el polipéptido con una mezcla de butirato de sodio y ácido mirístico.

FIGURA 1B

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