Composición seca de compuestos de reacción con una polimerasa estabilizada.

Método para producir una composición seca de los compuestos de reacción almacenable,

y dicho método incluyelos pasos de

a) proporcionar una mezcla líquida de compuestos de reacción, y dicha mezcla líquida incluye cebadores,nucleótidos, una Taq DNA polimerasa y una primera molécula estabilizante, donde dicha primera moléculaestabilizante es una proteína, y

b) secar dicha mezcla líquida mediante la reducción de la presión que envuelve a dicha mezcla líquida,en el que dicha composición seca de los compuestos de reacción es soluble en solución acuosa,caracterizada de manera que dicha mezcla líquida de los compuestos de reacción del paso a) también incluye unaptámero como segunda molécula estabilizante, donde dicho aptámero tiene la capacidad de adherirse a una TaqDNA polimerasa.

Composición seca de compuestos de reacción con una polimerasa estabilizada Antecedentes de la invención Existen pocos compuestos de reacción que sean estables en forma soluble durante cualquier periodo de tiempo, y esto es especialmente cierto en relación al almacenamiento a temperatura ambiental. Por consiguiente, en el pasado se ha realizado una enorme cantidad de estudios para evaluar la posibilidad de potenciar las capacidades de almacenamiento de los compuestos de reacción biológicos en su forma seca.

En base a la gran cantidad de documentos del estado de la técnica en el campo de los compuestos de reacción secos, un experto en la materia estará seguro de que será esencial la utilización de, al menos, un aditivo estabilizante para asegurar la actividad biológica de, por ejemplo, una polimerasa tras la resolubilización.

La patente WO 2008/36544 describe la utilización de los denominados materiales de relleno para proporcionar composiciones secas, y tales materiales de relleno son, por ejemplo, carbohidratos tales como el FICOLL™, la sacarosa, la glucosa, la trehalosa, la melezitosa, el DEXTRAN™ o el manitol, proteínas tales como la BSA, la gelatina o el colágeno, y polímeros tales como el PEG o la polivinilpirrolidona (PVP) . Los materiales de relleno formadores de cristales para la estabilización de reactivos biológicos se describen en las patentes US 5.098.893, US

5.200.399 y US 5.240.843. El material de relleno FICOLL™ es un copolímero descrito en la patente US 3.300.474.

Además, la mayoría de las veces, los métodos de secado de las mezclas de reacción líquidas son muy complejos en su naturaleza, por lo que los procedimientos de secado son caros y exigentes. En la literatura, la liofilización (US 5.593.824) o el secado al vacío (US 5.565.318) se utilizan en el secado de materiales biológicos en un matriz de polímeros de carbohidratos. La liofilización o el secado por congelación es una técnica bien establecida en relación al almacenamiento de proteínas, y se ha descrito en muchos documentos del estado de la técnica (por ejemplo, Passot, S., et al., Pharmaceutical Development and Technology 12 (2007) 543-553; Carpenter, J.F., et al., Pharmaceutical Research 14 (8) (1997) 969-975; Schwegman, J.J., et al., Pharmaceutical Development and Technology 10 (2005) 151-173) .

En la patente US 7.407.747 se describe una selección de condiciones de secado para las diferentes mezclas de reacción para las aplicaciones de secuenciación que incluyen modificaciones genéticas de la Taq polimerasa. Los procedimientos de secado que se utilizan son la liofilización, el speedvac sin calentamiento adicional y el secado con aire a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción de esta patente se evaluaron en relación a varios crioprotectores, tales como la trehalosa, la sacarosa, la glucosa y el N-óxido de trimetilamina (TMANO) . Además, se realizaron experimentos sin ningún crioprotector, pero no se describió ningún dato concerniente a la estabilidad de esas mezclas de reacción con el tiempo. Solamente se describió una buena estabilidad de hasta 8 semanas en las mezclas de reacción que incluían trehalosa y albúmina sérica bovina (BSA) .

Además, la patente US 7.407.747 describe experimentos con la polimerasa en diferentes mezclas de secuenciación, y tales mezclas de secuenciación incluyen diferentes composiciones de la solución tampón, nucleótidos, nucleósidos con marcadores fluorescentes y cebadores. No se describe si la polimerasa, en mezclas para amplificaciones PCR a tiempo real, es decir, mezclas que incluyen la solución tampón, nucleótidos, cebadores y sondas de detección, puede secarse y almacenarse sin afectar la actividad PCR de la polimerasa.

La presente invención proporciona un método para el secado de una Taq DNA polimerasa en una mezcla de PCR a tiempo real, considerando que la composición seca obtenida puede almacenarse sin afectar la actividad PCR de la Taq DNA polimerasa.

Resumen de la invención Proporcionar una composición seca de compuestos de reacción que incluyen una polimerasa es un problema complejo, especialmente si se necesita almacenar dicha composición seca durante cierta cantidad de tiempo y si debe ser posible la subsiguiente resolubilización de dicha composición seca sin afectar la actividad polimerasa para las aplicaciones en la PCR.

Durante el secado de una solución líquida que incluye diferentes componentes, la concentración de dichos componentes aumentará continuamente, con el fin de cambiar drásticamente las propiedades, mientras el comportamiento exacto de la solución líquida dependerá de los componentes y del procedimiento de secado. El experto en la técnica apreciará que, por ejemplo, las concentraciones salinas elevadas desestabilizarán las proteínas y que los tampones alterarán su comportamiento a concentraciones elevadas para que aparezcan valores de pH extremos.

Tal y como se menciona con anterioridad, los expertos en la técnica conocerán ciertos compuestos que pueden añadirse a las soluciones que incluyen un polimerasa para potenciar la estabilidad de la polimerasa tras el secado.

Además, los expertos en la técnica no esperarán obtener los mismo resultados de secado para una polimerasa determinada si varían los componentes de la mezcla de la polimerasa.

Por ejemplo, la patente US 7.407.747 describe la posibilidad de secar una Taq polimerasa en una mezcla que incluye una solución tampón, nucleótidos, BSA y trehalosa, y la polimerasa se mantuvo activa hasta 8 semanas.

A lo largo de la presente invención se desarrollaron métodos para proporcionar una composición seca de una polimerasa para su aplicación en una PCR, y dicha composición no sólo contiene tampones y nucleótidos, sino que también incluye componentes adicionales para formar una mezcla de detección completa, es decir, cebadores e incluso cebadores y sondas.

Se descubrió que se puede secar y almacenar una mezcla líquida que contiene una polimerasa, nucleótidos y una molécula estabilizante sin afectar a la actividad polimerasa, mientras que la actividad polimerasa se pierde si se añaden cebadores adicionales a la mezcla líquida. Más detalladamente, la actividad PCR se pierde debido a la adición de los cebadores si la resolubilización se da directamente tras el procedimiento de secado.

La presente invención resolvió este problema en relación al aumento de la estabilidad de la Taq polimerasa para que la mezcla de la reacción que debe secarse pueda contener cebadores adicionales.

Sorprendentemente, se descubrió que la adición de un aptámero a la solución líquida potenció la estabilidad de la Taq polimerasa, y dicha estabilización fue buena tanto para el secado como para el almacenamiento de la mezcla seca.

En consecuencia, una aspecto de la presente invención es un método para producir una composición seca almacenable de compuestos de reacción, y dicho método incluye los pasos de a) proporcionar una mezcla líquida de compuestos de reacción, y dicha mezcla líquida incluye cebadores, nucleótidos, una Taq DNA polimerasa y una primera molécula estabilizante, y

b) secar dicha mezcla líquida mediante la reducción de la presión que envuelve a dicha mezcla líquida,

en el que dicha composición seca de compuestos de reacción es soluble en una solución acuosa, y se caracteriza porque dicha mezcla líquida de compuestos de reacción del paso a) también incluye un aptámero como segunda molécula estabilizante.

A lo largo de la presente invención, la oración "composición seca" se utiliza para enfatizar que la cantidad de disolvente, preferiblemente disolventes acuosos está reducida por debajo del 5% del peso.

A lo largo de la presente invención, la oración "composición seca almacenable" implica que la composición seca debe almacenarse durante al menos una semana, preferiblemente durante al menos 4 semanas, más preferiblemente durante más de 8 semanas, sin afectar a la actividad polimerasa.

Una "molécula estabilizante" en la presente invención es una molécula que mejora la resistencia de la polimerasa frente a la pérdida de su actividad PCR tras el secado de una solución acuosa que incluye dicha polimerasa.

Otro aspecto de la presente invención es una composición seca de compuestos de reacción que incluye cebadores, nucleótidos, una Taq DNA polimerasa, una primera molécula estabilizante y un aptámero como segunda molécula estabilizante, y dicha composición seca proporciona actividad PCR tras la resolubilización posterior al almacenamiento a temperatura ambiente durante, al menos, una semana.

Otro aspecto adicional de la presente invención es un método para la realización... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una composición seca de los compuestos de reacción almacenable, y dicho método incluye los pasos de a) proporcionar una mezcla líquida de compuestos de reacción, y dicha mezcla líquida incluye cebadores, nucleótidos, una Taq DNA polimerasa y una primera molécula estabilizante, donde dicha primera molécula estabilizante es una proteína, y

b) secar dicha mezcla líquida mediante la reducción de la presión que envuelve a dicha mezcla líquida,

en el que dicha composición seca de los compuestos de reacción es soluble en solución acuosa, caracterizada de manera que dicha mezcla líquida de los compuestos de reacción del paso a) también incluye un aptámero como segunda molécula estabilizante, donde dicho aptámero tiene la capacidad de adherirse a una Taq DNA polimerasa.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha primera molécula estabilizante es la caseína o la BSA.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho aptámero es un aptámero que tiene la secuencia Id. de Sec. Nº 9 o Id. de Sec. Nº 10.

4. El método de acuerdo con la reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha mezcla líquida de los compuestos de reacción es una solución acuosa tamponada que incluye una sal de magnesio.

5. El método de acuerdo con la reivindicaciones 1 a 4, en el que la presión que envuelve a la mezcla líquida se reduce en el paso b) hasta por debajo de los 600 mbar, preferiblemente por debajo de los 400 mbar; lo más preferible, a 200 mbar.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, en el que dicho secado del paso b) se lleva a cabo a temperatura ambiente.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 6, en el que dicha mezcla líquida de los compuestos de reacción también incluye sondas de detección, y preferiblemente dichas sondas de detección son sondas marcadas con fluorescencia.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 a 7, en el que dicha mezcla líquida de los compuestos de reacción también incluye moldes de DNA.

9. Una composición seca de los compuestos de reacción que incluye cebadores, nucleótidos, una Taq DNA polimerasa, una primera molécula estabilizante y un aptámero como segunda molécula estabilizante, donde dicha primera molécula estabilizante es una proteína, dicho aptámero tiene la habilidad de adherirse a la Taq DNA polimerasa, y dicha composición seca proporciona actividad PCR tras la resolubilización posterior al almacenamiento a temperatura ambiente durante, al menos, una semana.

10. La composición seca de los compuestos de reacción de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha composición seca de los compuestos de reacción también incluye sondas de detección.

11. La composición seca de los compuestos de reacción de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 10, donde dicha primera molécula estabilizante es la caseína o la BSA.

12. La composición seca de los compuestos de reacción de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 11, donde dicho aptámero es un aptámero que tiene la secuencia Id. de Sec. Nº 9 o Id. de Sec. Nº 10.

13. Método para la realización de la amplificación PCR, y dicho método incluye los pasos de

a) resolubilizar una composición seca de compuestos de reacción de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 12 mediante la adición de una solución acuosa, y

b) realizar un protocolo de termociclado con la solución acuosa que incluye los compuestos de reacción resolubilizados.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicha solución acuosa incluye un ácido nucleico diana que se ha de amplificar mediante el protocolo de termociclado.