Composición en forma de lámina.

Una composición en forma de lámina que comprende un amnios con trehalosa añadida.

Composición en forma de lámina

Campo técnico

Esta invención se refiere a una composición en forma de lámina utilizando un amnios y un método para producir la misma. La composición en forma de lámina según la invención tiene aplicación, por ejemplo, como sustrato de cultivo para la producción de tejidos artificiales (tales como epitelio de la cornea) , materiales de trasplante para la reconstrucción de superficies oculares, pieles, etc., y como materiales antiadhesivos.

Antecedentes de la técnica El amnios tiene propiedades preferibles como material de trasplante, tales como elevada biocompatibilidad y flexibilidad, y se ha descubierto su utilización en la reconstrucción del epitelio de la cornea y muchos otros tejidos (véanse los Documentos de Patente de 1 a 4) . La utilización del amnios puede clasificarse en gran medida en dos grupos. Es decir, se puede aplicar directamente en cualquier zona lesionada para reconstruir los tejidos, o se puede utilizar como un sustrato de cultivo para el cultivo de células. La flexibilidad del amnios es una propiedad crucial para cualquiera de estas aplicaciones. Debido a su alta flexibilidad, el amnios puede tapar la zona lesionada sin ningún hueco, con una adherencia favorable y disponerse en el sitio lesionado, lo que da como resultado un efecto terapéutico favorable. Por otro lado, cuando el amnios se aplica como un sustrato de cultivo para el cultivo de células, su alta flexibilidad le permite lograr una amplificación celular favorable y una organización (diferenciación) normal.

[Documento de Patente 1] Publicación de Patente Japonesa Nº 5-56987, Boletín [Documento de Patente 2] Publicación Internacional Nº 03/043542, Folleto A1 [Documento de Patente 3] Publicación Internacional Nº 03/92762, Folleto A1 [Documento de Patente 4] Publicación Internacional Nº 2004/078225, Folleto A1

El documento EP1454600 A1 describe una membrana amniótica crioconservada antes de su utilización. La mezcla líquida utilizada para congelar la membrana incluye glicerol.

CROWE J.H. et al en “The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dr y state” describe varias técnicas que utilizan trehalosa para la estabilización de biomateriales en un estado seco.

Descripción de la invención [Problemas a resolver por la invención]

El amnios cubre la capa más externa del útero y de la placenta en los mamíferos, y se obtiene durante el parto. En consecuencia, puesto que el amnios fresco no puede estar siempre disponible, la conservación a largo plazo y la disponibilidad son muy solicitadas en la utilización del amnios para aplicación clínica. Por consiguiente, los derivados del amnios se han almacenado en estado desecado para mejorar la conservación y la disponibilidad de utilización. El proceso de desecación, sin embargo, aunque proporciona una conservación significativamente mejorada, reduce en gran medida la flexibilidad del amnios al volver de nuevo a un estado húmedo debido a las proteínas constituyentes desnaturalizadas. Esta baja flexibilidad puede disminuir la cobertura de toda la zona de lesión, y disminuye la adhesividad y disposición sobre la misma. Además, una vez desecado, el amnios tiene una tasa de proliferación celular baja, e impide la disposición en capas, no permitiendo de esta manera una organización (diferenciación) normal. Esto puede ser debido a la disminución drástica de la planicidad de la superficie de amnios que acompaña a la reducción de la flexibilidad.

La presente invención, en busca de disolución a los problemas anteriores, persigue proporcionar una composición en forma de lámina que comprenda un amnios que tenga una capacidad de conservación y una disponibilidad de utilización superior, así como flexibilidad al utilizarse.

[Medios para resolver los problemas]

Con el fin de lograr el objetivo anterior, los presentes inventores intentaron primero modificar el amnios para mejorar la flexibilidad. Como resultado, si se trata con trehalosa, un disacárido, el amnios restaura su flexibilidad cuando vuelve al estado húmedo, incluso si ha sido desecado. Por otra parte, se encontró que la flexibilidad se restauraba a un nivel equivalente al del amnios no tratado (amnios fresco) . Por lo tanto, se reveló que el tratamiento con trehalosa es eficaz en la mejora de la flexibilidad del amnios.

Sorprendentemente, también se ha demostrado que el tratamiento con trehalosa tiene un efecto adicional de mejora de la transparencia del amnios. Por lo tanto, se demostró que el tratamiento del amnios con trehalosa es muy eficaz cuando se utiliza el amnios para cualquier aplicación donde se requiera la mayor transparencia posible (por ejemplo, en la reconstrucción de la córnea) .

Además, ya que el tratamiento con trehalosa aumentó la resistencia a la tracción del amnios y proporcionó un amnios más resistente que el fresco crudos, se demostró que el tratamiento con trehalosa es eficaz al mejorar la disposición de manipulación y conservación después del trasplante del amnios.

Además, puesto que se determinó que la biocompatibilidad del amnios tratado con trehalosa era tan alta como la del amnios fresco, se demostró que el tratamiento con trehalosa nunca afecta negativamente a la biocompatibilidad.

Por lo tanto, con el conocimiento acumulado, se examinó el efecto de la trehalosa en la función de la membrana amniótica como sustrato de cultivo celular. Específicamente, se cultivaron células epiteliales de la córnea en amnios que había sido tratado con trehalosa, y se determino la tasa de proliferación celular y la formación de capas sobre el mismo. Los resultados revelaron una proliferación celular favorable y la formación de 5-7 capas, lo que indica una mejora significativa comparada con la formación de capas (1-2 capas) en amnios que no había sido tratado con trehalosa. Por lo tanto, se demostró que el tratamiento con trehalosa es eficaz también en el uso de amnios como sustrato de cultivo celular.

A continuación, se trasplantó una lámina de amnios con capas de células formadas sobre la misma a la superficie de ojos animales para determinar el efecto de la reconstrucción. Como resultado de ello, se puso de manifiesto una adherencia y disposición favorable, sin defectos en la reconstrucción de la superficie del ojo, y sin embargo manteniendo una transparencia elevada.

La presente invención se basa principalmente en el conocimiento anteriormente indicado y proporciona una composición en forma de lámina tal como se describe a continuación.

[1] Una composición en forma de lámina que comprende un amnios al que se añade trehalosa.

[2] La composición en forma de lámina según [1], en estado congelado o desecado.

[3] La composición en forma de lámina según [2], en estado liofilizado.

[4] La composición en forma de lámina según [1] a [3], en la que el amnios es un amnios del que se eliminado la capa de células epiteliales.

[5] La composición en forma de lámina según [1] a [4], en la que el amnios tiene los componentes de la membrana basal Colágeno IV, Colágeno VII, y Laminina 5 que se detectan con una intensidad equivalente a la del amnios no tratado.

[6] La composición en forma de lámina según [1] a [5], en la que el amnios es un amnios humano.

[7] La composición en forma de lámina según [1] a [6], en la que la capa de células que consiste en células derivadas de tejidos se forma sobre el amnios.

[8] La composición en forma de lámina según [7], en la que las células derivadas de tejidos se disponen en capas en la capa de células.

[9] La composición en forma de lámina según [7], en la que las células derivadas de tejidos derivan del epitelio de la cornea, epitelio de la conjuntiva, epidermis de la piel, epitelio folicular, epitelio de la mucosa oral, el epitelio pigmentario del iris, epitelio pigmentario de la retina, epitelio de la mucosa de las vías respiratorias, o mucosa intestinal. 10] La composición en forma de lámina según [7], en la que la capa de células se compone de aproximadamente 5-7 capas de células, y tiene propiedades similares a las del epitelio de la córnea.

[11] La composición en forma de lámina según [1] a [6], para uso como materiales antiadhesivos o materiales para la reconstrucción de los tejidos superficiales dañados durante invasión quirúrgica.

[12] La composición en forma de lámina según [1] a [11], en la que el amnios tiene un componente adhesivo cualquiera que se fija a la superficie lateral corion.

[13] La composición en forma de lámina según [12], en la que el componente adhesivo es fibrinógeno y trombina.

[14]... [Seguir leyendo]

1. Una composición en forma de lámina que comprende un amnios con trehalosa añadida.

2. La composición en forma de lámina según la reivindicación 1, en un estado congelado o desecado.

3. La composición en forma de lámina según la reivindicación 2, en un estado liofilizado.

4. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el amnios es un amnios del que se eliminado la capa de células epiteliales.

5. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el amnios tiene los componentes de la membrana basal Colágeno IV, Colágeno VII, y Laminina 5 que se detectan con una intensidad equivalente a la del amnios no tratado.

6. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el amnios es un amnios humano.

7. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la capa de células que consiste en células derivadas de tejido se forma sobre dicho amnios.

8. La composición en forma de lámina según la reivindicación 7, en la que las células derivadas de tejido se disponen en capas en la capa de células.

9. La composición en forma de lámina según la reivindicación 7, en la que dichas células derivadas de tejidos derivan del epitelio de la cornea, del epitelio de la conjuntiva, de la epidermis de la piel, del epitelio folicular, del epitelio de la mucosa oral, del epitelio pigmentario del iris, del epitelio pigmentario de la retina, del epitelio de la mucosa de las vías respiratorias, o de la mucosa intestinal.

10. La composición en forma de lámina según la reivindicación 7, en la que la capa de células se compone de aproximadamente 5-7 capas de células, y tiene propiedades similares a las del epitelio de la córnea.

11. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso como materiales antiadhesivos o materiales para la reconstrucción de los tejidos superficiales dañados durante invasión quirúrgica.

12. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el amnios tiene un componente adhesivo cualquiera que se fija a la superficie del lado del corion.

13. La composición en forma de lámina según la reivindicación 12, en la que dicho componente adhesivo es fibrinógeno y trombina.

14. La composición en forma de lámina según la reivindicación 12, en la que dicho componente adhesivo es fibrinógeno, trombina y aprotinina.

15. La composición en forma de lámina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la superficie coriónica del amnios está recubierta con material bioabsorbible.

16. Método de trasplante que utiliza una cualquiera de las composiciones en forma de lámina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como material de implante.

17. Un método para producir una composición en forma de lámina, que comprende las etapas de:

(a) preparación de un amnios; y

(b) adición de trehalosa a dicho amnios.

18. El método según la reivindicación 17, que comprende además la etapa de: (c) congelación o desecación de dicho amnios después de la etapa (b) .

19. El método según la reivindicación 18, que comprende además la etapa de: (d) esterilización dicho de amnios después de la etapa (c) .

20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la etapa (a) comprende la etapa de: (a1) eliminación del epitelio de dicho amnios.

21. El método según la reivindicación 20, donde la etapa (a1) comprende las siguientes etapas de:

(1) preparación de un amnios separado de un organismo,

(2) congelación-descongelación de dicho amnios,

(3) exposición de dicho amnios después de la congelación-descongelación a un tratamiento con tripsina,

(4) lavado de dicho amnios después del tratamiento con tripsina.

22. El método según la reivindicación 21, en el que la temperatura de congelación durante el proceso de

congelación-descongelación es de aproximadamente -20º C a aproximadamente -80º C, y la temperatura de 5 descongelación es de aproximadamente 4º C a aproximadamente 50º C.

23. El método según la reivindicación 21 o 22, caracterizado por la repetición de dicho proceso de congelacióndescongelación dos veces o más.

24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado por que el tratamiento con tripsina

se realiza utilizando una disolución de tripsina que tiene una concentración de tripsina de aproximadamente 0, 01% 10 (p/v) a aproximadamente 0, 05% (p/v) .

25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque la disolución de tripsina comprende aproximadamente de 0, 1 mM a aproximadamente 0, 6 mM de un quelante seleccionado del grupo que consiste en EDTA, NTA, DTPA, HEDTA, GLDA, y cualquier combinación de los mismos.

26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizado por que el tratamiento con tripsina

se realiza de tal manera que la disolución de tripsina se pone en contacto solamente con cara epitelial de dicho amnios.

27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en el que la siguiente etapa;

(A) formación de una capa de células que consiste en células derivadas de tejidos sobre dicho amnios se lleva a cabo después de la etapa de (b) .