Composición de matriz extracelular.

Procedimiento para preparar una composición de matriz extracelular que comprende:

(a) mezclar una disolución acuosa de fibrinógeno con un agente coagulante y un agente de carga y unagente espumante;

(b) incubar la mezcla obtenida en la etapa 5 (a) con un agente de reticulación seleccionado de: agentes deacoplamiento de carbodiimida tales como N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC); Nhidroxisuccinimida(NHS), agentes de acoplamiento de azida; agentes de reticulación de diisocianato talescomo diisocianato de hexametileno; agentes de reticulación de epóxido tales como epiclorhidrina, glicidiléteres y glicidilaminas; y agentes de reticulación de aldehído tales como formaldehído, glutaraldehído yglioxal; y

(c) lavar la composición reticulada obtenida en la etapa (b) para eliminar el agente de reticulación.

Composición de matriz extracelular

La invención se refiere a un procedimiento para preparar una composición de matriz extracelular que comprende fibrinógeno reticulado o un derivado del mismo, a una composición de matriz extracelular obtenida mediante dicho procedimiento y al uso de dicha composición en la cicatrización de heridas con pérdida de piel de grosor completo, regeneración de tejido o como soporte de ingeniería de tejidos.

Las heridas que implican pérdida de piel de grosor completo abarcan un amplio espectro de etiología patológica de las tres heridas crónicas principales: úlceras por presión, úlceras venosas y úlceras diabéticas en heridas por traumatismo y quemaduras. Las heridas crónicas y agudas que implican pérdida de piel de grosor completo son potencialmente mortales y pueden ser letales. Estas heridas provocan estrés fisiológico, estructuras significativas expuestas de manera invariable y son muy costosas de tratar. Pueden tener graves consecuencias ya que alteran la función protectora de la piel, aumentando las posibilidades de infección y conduciendo a pérdida de fluido. Además, también pueden provocar al paciente molestia física, emocional y social considerable ya que no cicatrizan fácilmente.

A medida que ha progresado el entendimiento básico de los científicos sobre las heridas y los mecanismos de cicatrización de heridas, se han desarrollado varios enfoques diferentes para el tratamiento de heridas. Sin embargo, aunque las heridas pequeñas se han beneficiado de avances tales como cierre con colgajo microquirúrgico y la llegada de presión negativa tópica, los intentos por mejorar las técnicas de tratamiento para heridas grandes han sido menos satisfactorios.

Esto es debido a que las heridas grandes necesitan cubierta de piel para lo que hay varias soluciones no satisfactorias. Los injertos de piel de grosor parcial, que eliminan el tejido requerido del paciente provocando lesión adicional, no estimulan la regeneración de dermis perdida y de ese modo a menudo dan como resultado formación de cicatrices graves. Además, los queratinocitos cultivados pueden tardar aproximadamente un mes en prepararse y cuando se aplican a una herida sin una dermis adecuada, también dan como resultado una cicatrización grave a largo plazo.

Por esta razón, se han introducido en el foro clínico composiciones de matriz extracelular tales como composiciones de soporte dérmico y están viendo un aumento de su uso (al menos en el R.U.) durante la última década. Se ha reconocido que estas composiciones deben tener propiedades particulares que les permitan reducir la cicatrización y contracción de heridas. El material debe poder soportar la adhesión celular; ser lo suficientemente rígido para resistir el colapso bajo las fuerzas de tracción ejercidas por células en crecimiento; así como ser resistente a la degradación proteolítica rápida de modo que sobreviva en un entorno de herida para que se produzca la fibroproliferación.

Actualmente, el colágeno es el componente principal de composiciones de soporte dérmico. Se ha considerado el colágeno como soporte pasivo, permisivo para permitir la conductancia celular. La entrada de células endoteliales y fibroblastos cultivados en materiales colagenosos es limitada. La experiencia clínica indica que en heridas difíciles la “captación”, (es decir la unión satisfactoria de un injerto a la piel de un paciente) de tales soluciones basadas en colágeno puede ser de varias semanas. Como tales, a menudo presentan infección, seromas y hematomas, y con frecuencia fracasan con graves consecuencias.

La evidencia reciente sugiere que el fibrinógeno puede tener propiedades críticas relevantes a la angiogénesis (Potter et al. (2006) Plast. Reconstr. Surg. 117 (6) , 1876-1885) que es un procedimiento fisiológico que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes. La angiogénesis es particularmente crítica para el procedimiento de reparación de heridas, no pudiendo algunas células sobrevivir si están > 100 !m del capilar funcional más cercano (Langer et al. Tissue Eng 1995:1:151-161) . El documento US 2004/0229333 (Bowlin et al.) da a conocer una serie de matrices y tejidos a base de fibrina electroprocesada.

Se ha identificado el fibrinógeno como un potencial componente en una dermis sintética (Baldwin et al.: Development of a pro-angiogenic matrix for synthetic dermis using cultured endothelial cells. Institute Pasteur Euroconferences 40, 2005) .

El documento WO 2004/067704 da a conocer una matriz de fibrina porosa para soportar el crecimiento celular tridimensional. La matriz está formada por proteínas de plasma comprendiendo fibrinógeno, trombina y un aditivo seleccionado de glicosaminoglicano pero no comprende agente de reticulación ni espumante.

El objeto de esta invención es proporcionar una composición de matriz extracelular, estable que interaccione activamente con células, particularmente para fomentar la adhesión de células endoteliales, aumentando la probabilidad de “captación” y por tanto el éxito del material de matriz artificial.

Por tanto, según un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para preparar una composición de matriz extracelular que comprende:

(a) mezclar una disolución acuosa de fibrinógeno con un agente coagulante y un agente de carga y un agente

espumante

(b) incubar la mezcla obtenida en la etapa (a) con un agente de reticulación seleccionado de: agentes de acoplamiento de carbodiimida tales como N- (3-dimetilaminopropil) -N’-etilcarbodiimida (EDC) ; N-hidroxisuccinimida (NHS) , agentes de acoplamiento de azida; agentes de reticulación de diisocianato tales como diisocianato de hexametileno; agentes de reticulación de epóxido tales como epiclorhidrina, glicidil éteres y glicidilaminas; y agentes de reticulación de aldehído tales como formaldehído, glutaraldehído y glioxal y

(c) lavar la composición reticulada obtenida en la etapa (b) para eliminar el agente de reticulación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “matriz extracelular” se refiere a una estructura, soporte o plataforma compuesta por un material química o bioquímicamente definido al que pueden adherirse diversas células (por ejemplo dérmicas, musculares, nerviosas, de tejido conjuntivo, de fascia, de duramadre o peritoneales) de vertebrados superiores y multiplicarse sin provocar toxicidad o inhibición de replicación celular.

El fibrinógeno tiene una masa molecular de 340 kDa (Doolittle, R.F. Annu Rev Biochem. 1984; 53:195-229) y está compuesto por tres pares de cadenas de polipéptido (A∀B#∃) 2. Los extremos amino terminales de los tres pares de cadenas están unidos entre sí mediante enlaces disulfuro en la región central de la molécula. Los extremos carboxilo terminales de las cadenas B# contienen las regiones de extremo proximal, y los extremos carboxilo terminales de la cadena ∃ contienen las regiones de extremo distal (Weisel, J.W., Stauffacher, C.V., Bullitt, E., Cohen, C. Science. 1985; 230:1388-1391) .

El fibrinógeno puede escindirse en diversos sitios diferentes para producir fragmentos de fibrina. Por ejemplo, el fibrinógeno puede dividirse en fragmento A, B, C y X usando plasmina. El fragmento X puede dividirse entonces en fragmento Y y fragmento D. El fragmento Y puede dividirse adicionalmente para producir otro fragmento D y fragmento E.

Las referencias a “fibrinógeno o un derivado del mismo” incluyen por tanto referencias a fibrinógeno nativo purificado de plasma, fragmentos de fibrinógeno o análogos de fibrinógeno. Se apreciará que cualquier fragmento o análogo del mismo debe conservar la función angiogénica de fibrinógeno nativo y se ha mostrado en el presente documento que los productos de degradación mencionados anteriormente imitan el efecto proangiogénico del fibrinógeno nativo.

Se apreciará que las referencias a fibrinógeno purificado incluyen fibrinógeno a un nivel de pureza superior a uno del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o el 99%.

Ejemplos de fragmentos de fibrinógeno incluyen formas truncadas de fibrinógeno, tales como fibrina A, fibrina B, fibrina C, fibrina D, fibrina X y fibrina Y. En una realización adicional, la forma truncada de fibrinógeno es fibrina E.

Los ejemplos de análogos de fibrinógeno incluyen un derivado modificado de fibrinógeno en el que se han sustituido uno o más residuos de aminoácido del péptido por otros residuos de aminoácido sintéticos o que se producen de

manera natural y/o en el que se han eliminado uno o más residuos de aminoácido del péptido y/o en el que... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar una composición de matriz extracelular que comprende:

(a) mezclar una disolución acuosa de fibrinógeno con un agente coagulante y un agente de carga y un agente espumante;

(b) incubar la mezcla obtenida en la etapa (a) con un agente de reticulación seleccionado de: agentes de acoplamiento de carbodiimida tales como N- (3-dimetilaminopropil) -N’-etilcarbodiimida (EDC) ; Nhidroxisuccinimida (NHS) , agentes de acoplamiento de azida; agentes de reticulación de diisocianato tales como diisocianato de hexametileno; agentes de reticulación de epóxido tales como epiclorhidrina, glicidil éteres y glicidilaminas; y agentes de reticulación de aldehído tales como formaldehído, glutaraldehído y

glioxal; y

(c) lavar la composición reticulada obtenida en la etapa (b) para eliminar el agente de reticulación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que está presente fibrinógeno a un nivel de pureza superior a uno del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o el 99%.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que está presente fibrinógeno como

formas truncadas de fibrinógeno, tales como fibrina A, fibrina B, fibrina C, fibrina D, fibrina X, fibrina Y y fibrina E.

4. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que está presente fibrinógeno como una disolución acuosa tamponada a un pH de entre 4 y 10 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con HEPES; o en el que el agente coagulante comprende un agente coagulante enzimático o no enzimático, que puede ser trombina, tal como trombina humana.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente espumante es un detergente no iónico, tensioactivo de gelificación termosensible (por ejemplo Pluronic 127) , fosfolípido de tipo difosfatidilglicerol o una mezcla de una fase inmiscible con la fase de disolución acuosa de fibrinógeno.

6. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de carga es un alginato, tal como alginato de sodio o un alginato derivatizado, tal como propilglicoalginato de sodio.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente de carga es un glicosaminoglicano (GAG; por ejemplo 6-sulfato de condroitina, 4-sulfato de condroitina, heparina, sulfato de heparina, sulfato de queratano, sulfato de dermatano, quitina, quitosano, sulfato de dextrano o hialuronano) .

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente de reticulación comprende un agente de reticulación de aldehído tal como formaldehído, glutaraldehído y glioxal.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente la adición de un agente reductor o un agente reductor de toxicidad, tal como borohidruro de sodio o lisina.

10. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de mezclado (a) se logra mediante espumación, tal como mezclado con aireación, y/o en el que la mezcla obtenida en la etapa (a) se cuela, congela y opcionalmente se liofiliza antes de la etapa de incubación (b) , y/o que comprende adicionalmente la adición de un ión de metal divalente o multivalente tal como calcio (por ejemplo cloruro de calcio) .

11. Composición de matriz extracelular que puede obtenerse mediante un procedimiento según cualquier 40 reivindicación anterior.

12. Composición de matriz extracelular según la reivindicación 11, para su uso en la cicatrización de heridas, regeneración de tejido o como soporte de ingeniería de tejidos in vitro, ex vivo o in vivo.

Concentración reticulación GTA

Concentración reticulación GTA