Coexpresión recombinante de la subunidad 1 de la epóxido reductasa de la vitamina K para mejorar la expresión de proteína dependiente de la vitamina K.

Un organismo hospedador que contiene un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 delcomplejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) y un ácido nucleico recombinante que codifica una proteínadependiente de la vitamina K (VKD),

en el que tanto la VKORC1 recombinante como la proteína VKD recombinantese expresan en dicho organismo hospedador, y en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada deforma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKDen un organismo hospedador que no coexpresa rVKORC1.

Coexpresión recombinante de la subunidad 1 de la epóxido reductasa de la vitamina K para mejorar la expresión de proteína dependiente de la vitamina K

Campo de la invención La presente invención se refiere a un organismo hospedador que contiene ácidos nucleicos recombinantes que codifican la subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) y ácidos nucleicos recombinantes que codifican una proteína dependiente de la vitamina K (VKD) , expresándose en dicho organismo hospedador tanto la VKORC1 recombinante como la proteína VKD recombinante. Además, la presente invención se refiere a un sistema de cultivo celular que comprende células que contienen dichos ácidos nucleicos recombinantes y a procedimientos para mejorar la productividad de la expresión de la proteína VKD recombinante en un organismo hospedador que se cultiva en sistemas adecuados, es decir para aumentar las tasas de secreción.

Antecedentes de la invención El complejo epóxido reductasa de la vitamina K (VKORC) recicla la forma reducida de la vitamina K que es un cofactor esencial para la y-carboxilación post-traduccional de las proteínas dependientes de la vitamina K (VKD) (Nelsestuen, G.L., Zytkovicz, T.H., y Howard, J.B. (1974) The mode of action of vitamin K. Identification of gammacarboxyglutamic acid as a component of prothrombin. J. Biol. Chem., 249, 6347-6350) . El gen VKORC1 se identificó recientemente, y se describe con detalle en Rost y col., 2004 (Rost, S., Fregin, A., Ivaskevicius, V., Conzelmann, E., Hortnagel, K., Pelz, H.J., Lappegard, K., Seifried, E., Scharrer, I., Tuddenham, E.G., Muller, C.R., Strom, T.M., y Oldenburg, J. (2004) Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature, 427, 537-541) .

La proteínas VKD contienen restos de glutamato y-carboxilados (gla) que les proporcionan propiedades fisiológicas y bioquímicas específicas tales como la unión dependiente de Ca a membranas de fosfolípidos cargados negativamente en el caso de los factores de coagulación sanguínea (Mann, K.G., Jenny, R.J., y Krishnaswamy, S. (1988) Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Annu. Rev. Biochem., 57, 915-956) . Las proteínas VKD incluyen los factores procoagulantes II, VII, IX y X, y las proteínas anticoagulantes C, S y Z. Aunque está restringida a una sola reacción enzimática conocida, la actividad de la y-carboxilasa se encuentra en todos los tejidos de mamíferos (Vermeer, C. y de Boer-van den Berg MA (1985) Vitamin K-dependent carboxylase. Haematologia (Budap.) , 18, 71-97) . La y-carboxilasa cataliza una reacción de carboxilación que usa la vitamina K reducida como cofactor.

La gamma carboxilación dependiente de la vitamina K (VKD) de los restos de ácido glutámico es una modificación post-traduccional de proteínas requerida para la generación de proteínas VKD biológicamente activas que tienen funciones en la hemostasia, el control del crecimiento, la homeostasia del calcio y la transducción de señales (Furie, B., Bouchard, B.A., y Furie, B. C. (1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808; Berkner, K. L. (2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr., 130, 1877-1880) . Varios restos de ácido glutámico en el dominio Gla N-terminal de estas proteínas se modifican por carboxilación para permitir las interacciones dependientes de calcio de las membranas de fosfolípidos (Stenflo, J. y Suttie, J.W. (1977) Vitamin Kdependent formation of gamma-carboxyglutamic acid. Annu. Rev. Biochem., 46, 157-172; Suttie, J. W. (1980) Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-carboxyglutamic acid. CRC Crit. Rev. Biochem., 8, 191-223) . Estos restos múltiples de gamma-glutamato (Gla) permiten que el dominio Gla experimente cambios conformacionales que se requieren para la actividad de las proteínas VKD en combinación con la unión a las superficies de las membranas de fosfolípidos (Nelsestuen, G.L., Broderius, M., y Martin, G. (1976) Role of gammacarboxyglutamic acid. Cation specificity of prothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251, 68866893; Zwaal, R.F., Comfurius, P., y Bevers, E.M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1376, 433-453) .

Las proteínas VKD de la coagulación sanguínea requieren una carboxilación completa o casi completa para unirse a las superficies de las membranas en presencia de iones de calcio (Furie, B. y Furie, B.C. (1988) The molecular basis of blood coagulation. Cell, 53, 505-518) . Si los antagonistas de la vitamina K inhiben la gamma carboxilación, las proteínas VKD infracarboxiladas debido a esta inhibición no pueden formar la estructura dependiente del calcio, lo que da como resultado una baja afinidad por las membranas de fosfolípidos y una menor actividad (Esmon, C.T., Sadowski, J.A., y Suttie, J.W. (1975a) A new carboxylation reaction. The vitamin K-dependent incorporation of H-14-CO3- into prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4744-4748; Esmon, C.T., Suttie, J.W., y Jackson, C.M. (1975b) The functional significance of vitamin K action. Difference in phospholipid binding between normal and abnormal prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4095-4099; Malhotra, O.P., Nesheim, M.E., y Mann, K.G. (1985) The kinetics of activation of normal and gamma-carboxyglutamic acid-deficient prothrombins. J. Biol. Chem., 260, 279-287) . Por ejemplo, las contribuciones al total de perdida de actividad proteínica se pueden asignar a la ausencia de cada uno de los 10 restos Gla de la proteína C humana activada por la proteína VKD (Zhang, L., Jhingan, A., y Castellino, F.J. (1992) Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated human protein C in defining its in vitro anticoagulant activity. Blood, 80, 942-952) . La pérdida de la actividad procoagulante de los mutantes con el factor IX insuficientemente carboxilado que se encuentra en los pacientes con hemofilia B se puede justificar por cambios conformacionales anómalos inducidos por el calcio y la pérdida de capacidad para unirse a las vesículas de fosfolípidos (Ware, J., Diuguid, D.L., Liebman, H.A., Rabiet, M.J., Kasper, C.K., Furie, B.C., Furie, B., y Stafford,

D.W. (1989) Factor IX San Dimas. Substitution of glutamine for Arg-4 in the propeptide leads to incomplete gammacarboxylation and altered phospholipid binding properties. J. Biol. Chem., 264, 11401-11406) .

En el caso del factor IX recombinante, se ha demostrado que la expresión del factor IX funcional en las células de ovario de hámster chino está limitada por el hecho de que la capacidad para la carboxilación se satura a mayores niveles de producción (Kaufman, R.J., Wasley, L.C., Furie, B.C., Furie, B., y Shoemaker, C.B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovar y cells. J. Biol. Chem., 261, 9622-9628; Derian, C.K., VanDusen, W., Przysiecki, C.T., Walsh, P.N., Berkner, K.L., Kaufman, R.J., y Friedman, P.A. (1989) Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian expression systems. J. Biol. Chem., 264, 6615-6618) .

Se demostró que la sobreexpresión recombinante de proteínas y-carboxiladas, en el caso del factor IX humano, daba lugar a una limitación de la escisión del propéptido y a una y-carboxilación a mayores tasas de secreción, produciéndose de esta manera proteínas que solo estaban parcialmente ocupadas con restos gla incluso cuando la vitamina K estaba disponible en exceso en el medio de cultivo. Esto lleva a la secreción de variantes de proteínas recombinantes VKD con actividades reducidas. La adición de vitamina K al medio no mejoraba la actividad del factor IX a niveles altos de expresión. Se demostró que el requisito de vitamina K presente en el medio de cultivo celular para inducir el factor IX activo alcanzaba la saturación a 5 !g/ml. Por debajo de este nivel, la cantidad secretada de factor IX activo por las células de ovario de hámster chino (CHO) dependía de la concentración de vitamina K (Kaufman, R.J., Wasley, L.C., Furie, B.C., Furie, B., y Shoemaker, C.B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovar y cells. J. Biol. Chem., 261, 9622-9628) .

Hasta ahora se han elegido líneas celulares con niveles bajos de expresión para la producción con el fin de subsanar estas limitaciones de capacidad celular para modificar las proteínas VKD post-traduccionalmente. La coexpresión de Furin, la enzima que escinde el propéptido, da lugar a la escisión completa de este propéptido (Wasley, L.C., Rehemtulla, A., Bristol, J.A., y Kaufman, R.J. (1993) PACE/furin... [Seguir leyendo]

1. Un organismo hospedador que contiene un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) y un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína dependiente de la vitamina K (VKD) , en el que tanto la VKORC1 recombinante como la proteína VKD recombinante se expresan en dicho organismo hospedador, y en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada de forma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKD en un organismo hospedador que no coexpresa rVKORC1.

2. El organismo hospedador de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica la VKORC1 recombinante

o el ácido nucleico que codifica la proteína VKD recombinante o ambos se expresan mediante un modo de expresión seleccionado del grupo que consiste en expresión inducida, transitoria y permanente.

3. El organismo hospedador de la reivindicación 1 o 2, en el que el organismo hospedador es una célula de mamífero.

4. El organismo hospedador de la reivindicación 3, en el que la célula de mamífero es una célula derivada de una línea celular de mamífero seleccionada del grupo que consiste en células CHO y células HEK293.

5. El organismo hospedador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína VKD recombinante es un factor sanguíneo procoagulante.

6. El organismo hospedador de la reivindicación 5, en el que el factor sanguíneo procoagulante se selecciona del grupo que consiste en factor II, factor VII, factor IX y factor X.

7. El organismo hospedador de la reivindicación 6, en el que el factor sanguíneo procoagulante es el factor FIX humano.

8. Un sistema de cultivo celular que comprende células que contienen un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) y un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína dependiente de la vitamina K (VKD) , en el que tanto la VKORC1 recombinante como la proteína VKD se expresan en dichas células, y en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada de forma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKD en un organismo hospedador que no coexpresa rVKORC1.

9. El sistema de cultivo celular de la reivindicación 8, en el que las células cultivadas son células de mamífero.

10. El sistema de cultivo celular de la reivindicación 9, en el que las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en células CHO y células HEK293.

11. El sistema de cultivo celular de la reivindicación 8 a 10, en el que la proteína VKD recombinante es un factor sanguíneo procoagulante.

12. El sistema de cultivo celular de la reivindicación 11, en el que el factor sanguíneo procoagulante se selecciona del grupo que consiste en factor II, factor VII, factor IX y factor X.

13. El sistema de cultivo celular de la reivindicación 12, en el que el factor sanguíneo procoagulante es el factor IX humano.

14. Un procedimiento para incrementar la tasa de secreción de una proteína recombinante dependiente de la vitamina K (VKD) en un organismo hospedador, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un organismo hospedador;

(b) insertar un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína VKD en el organismo hospedador de la etapa (a) ;

(c) insertar un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) en el organismo hospedador de la etapa (a) ; y

(d) expresar los ácidos nucleicos recombinantes de las etapas (b) y (c) ;

en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada de forma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKD en un organismo hospedador que no coexpresa rVKORC1.

15. Un procedimiento para incrementar la tasa de secreción de una proteína recombinante dependiente de la vitamina K (VKD) en un organismo hospedador, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un organismo hospedador que tiene un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína VKD integrado en su genoma;

(b) insertar un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina

K (VKORC1) en el organismo hospedador de la etapa (a) ; y

(c) expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b) ;

en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada de forma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKD en un organismo hospedador que no 5 coexpresa rVKORC1.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el ácido nucleico recombinante que codifica una proteína VKD se expresa establemente.

17. Un procedimiento para incrementar la tasa de secreción de una proteína dependiente de la vitamina K (VKD) recombinante en un organismo hospedador, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un organismo hospedador que tiene un ácido nucleico recombinante que codifica una subunidad 1 del complejo reductasa de la vitamina K (VKORC1) integrado en su genoma;

(b) insertar un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína VKD en el organismo hospedador de la etapa (a) ; y

(c) expresar los ácidos nucleicos de las etapas (a) y (b) ;

en el que la tasa de secreción de la proteína VKD expresada de forma recombinante está sustancialmente incrementada cuando se compara con la expresión de la proteína rVKD en un organismo hospedador que no coexpresa rVKORC1.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el ácido nucleico recombinante que codifica VKORC1 se expresa establemente.