Cepa transformada derivada de una cepa deficiente en proteína de eflujo multifármaco y método de bioconversión utilizando la misma.

Transformante que se puede obtener por introducción de un gen originado a partir de un organismo xerogénico quecodifica cualquier enzima seleccionada del grupo que consiste en oxidorreductasa y transferasa en E.

coli que esdefectuoso en cualquier gen de los genes que codifican la proteína de eflujo multifármaco seleccionado del grupo queconsiste en tolC y acrAB.

Cepa transformada derivada de una cepa deficiente en proteína de eflujo multifármaco y método de bioconversión utilizando la misma Referencia cruzada a solicitudes relacionadas [0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad a la solicitud de patente japonesa nº: 2007-50935 presentada el 1 de marzo de 2007.

Campo técnico

La presente invención se refiere a cepas transformadas que son obtenibles por introducción de un gen originado a partir de organismos xerogénicos que codifican cualquier enzima seleccionada del grupo que consiste en oxidorreductasa y transferasa en el E. coli que es defectuoso en cualquier gen de los genes que codifican la proteína de eflujo multifármaco seleccionado del grupo que consiste en tolC y acrAB, y a un método para conversión microbiana de compuesto de sustrato utilizando las mismas.

Estado de la técnica

En general, los medios de producción de compuestos incluyen la síntesis química y la síntesis enzimática. Para producir los compuestos que pueden ser materiales para una variedad de productos farmacéuticos, es esencial efectuar eficazmente modificaciones regioespecíficas y esteroespecíficas de los compuestos iniciales. Se sabe que la síntesis enzimática es superior en términos de estas reacciones.

Para utilizar una enzima como catalizador práctico a nivel industrial, no obstante, se tiene que tener en cuenta elmargen fundamental de la enzima. Éste comprende una extensión de vida corta de la enzima y la necesidad de una coenzima para eventos catalíticos. Se ha puesto mucha atención hasta el momento en la forma de ampliar el periodo de vida de la enzima y retener la actividad enzimática en el diseño de procesos de fabricación con la enzima. Además, la mayoría de las enzimas utilizadas para la síntesis enzimática requieren coenzimas en los eventos catalíticos y, por ejemplo, las reacciones enzimáticas para la oxidación-reducción requieren un nucleótido de piridina, tal como NADH. Estas coenzimas son costosas en general y, por lo tanto, la adición de coenzima se ha convertido en una cuestión económicamente importante cuando se llevan a cabo reacciones enzimáticas a nivel industrial.

Como solución para superar el margen de estas reacciones enzimáticas, se ha desarrollado una estrategia utilizando células de un microorganismo, particularmente de E. coli, como campo para la reacción enzimática. Esto es, mediante la transformación de E. coli con un gen enzimático, la enzima objetivo se puede expresar abundantemente en la célula. Esto significa que la enzima se produce continuamente en la célula y la actividad enzimática se puede retener puesto que la célula está viva. Además, una variedad de reacciones intracelulares de metabolismo permiten que se generen las coenzimas necesarias para las reacciones enzimáticas.

Se ha intentado producir las sustancias químicas que pueden ser variedades de materiales farmacéuticos mediante "conversión microbiana", que comprende el cultivo de tal transformante de E. coli en un medio de cultivo y puesta en contacto del cultivo con un compuesto de sustrato para obtener el compuesto modificado. En particular, la reacción de oxidación por conversión microbiana de un compuesto hidrofóbico o amfipático usando E. coli que se ha transformado con un gen de citocromo P-450 es importante en la industria farmacéutica.

Una enzima de citocromo P-450 que se codifica con un gen de citocromo P-450 (de ahora en adelante también denominado simplemente enzima P-450) es el término genérico para un grupo del protohemo que contiene la proteína que está ligada al monóxido de carbono en su forma reducida para dar la banda de Soret en aproximadamente 450 nm. La enzima P-450 está ligada a los tejidos de la mayoría de los animales y plantas, al microsoma de mohos y levaduras y a la membrana interna mitocondrial de una parte de los tejidos animales y existe en algunos tipos de bacterias y mohos en su forma soluble.

Las enzimas P-450 tienen diferentes especificidades de sustrato. Hay enzimas que muestran una especificidad de sustrato extraordinariamente amplia que pueden utilizar una gran variedad de compuestos orgánicos como sustrato, mientras que algunas enzimas tienen una especificidad de sustrato más bien estrecha que reaccionan sólo con tipos comparativamente limitados de compuestos orgánicos. También algunas muestran una excelente selectividad en estéreo-especificidad o regio-especificidad para el sitio de reacción. Además, se sabe que las enzimas P-450 están implicadas, como funciones específicas, en una amplia variedad de reacciones, tales como la epoxidación, desalquilación, desnitrogenación e hidroxilación de xenobióticos en las células que exhiben las enzimas P-450 por catalización de la mono-oxigenación.

En particular, una parte de las enzimas P-450 originadas a partir de microorganismos se ha utilizado prácticamente para la producción industrial de compuestos útiles. Uno de los ejemplos típicos es la enzima P-450 de Storeptomyces carbophilus, que hidroxila la posición 6β de la compactina, un sustrato, para producir pravastatina como un producto que es un agente terapéutico para la hiperlipidemia (véase el punto Literatura distinta de la de patentes 1) . Además, el método para producir vitamina activa D3 por hidroxilación de la posición 1α y la posición 25 de la vitamina D3 utilizando la enzima P-450 de la cepa ATCC33795 de Pseudonocardia autotrophica se ha puesto en uso práctico. Estas enzimas P-450 originadas a partir del microorganismo pueden catalizar la mono-oxigenación sólo por conjugación con el sistema de transporte de electrones (ferredoxina y ferredoxina reductasa) que dona electrones a las enzimas.

Tal conversión microbiana de compuestos que utilizan la enzima P-450 de citocromo originada a partir de microorganismos se ha realizado usando una solución de cultivo o cuerpo bacteriano del microorganismo que expresaba la enzima. Se ha utilizado también otra solución de cultivo que se da por introducción de un gen que codifica la enzima P-450 originada a partir de microorganismos en el Storeptomyces lividans adecuado como huésped, y se hizo que expresara su actividad enzimática. No obstante, la conversión microbiana de un compuesto de sustrato por un actinomiceto que tiene tal gen requiere un tiempo considerable para cultivar y convertir el compuesto de sustrato en el producto objetivo debido a la naturaleza única de los actinomicetos. Además, dependiendo de la enzima, es preciso investigar las condiciones inductoras de expresión para aumentar eficazmente el nivel de expresión de la enzima. Por otra parte, algunos actinomicetos usados para la conversión tienen un sistema de reacción que metaboliza o degrada el compuesto de sustrato o el producto objetivo, y esto contribuye a la generación de subproductos y la reducción en el compuesto de sustrato y el producto objetivo para bajar la productividad del producto objetivo.

Por estas razones, se ha querido establecer un sistema que pueda expresar funcionalmente el gen de citocromo P-450 originado a partir de microorganismos y que utilice como huésped un E. coli que requiere un periodo de tiempo relativamente corto para el cultivo y también se considera que tiene menos sistemas de reacción para metabolizar o degradar el compuesto de sustancia y el producto objetivo. Como tal sistema, se ha propuesto un sistema que coexpresa el gen camAB que codifica el sistema de transporte de electrones de P450cam y hace que se exprese funcionalmente el gen de citocromo P-450 de una amplia variedad de actinomicetos (véase Documento de patente 1) . No obstante, la actividad de conversión microbiana por este sistema fue bastante baja e inadecuada para su utilización en la producción industrial. Por lo tanto, con el fin de llevar a cabo realmente la producción industrial por conversión microbiana utilizando E. coli que exprese el gen que codifica la enzima P-450 de citocromo originada a partir de microorganismos, se ha requerido una mayor mejora de la actividad.

Como la técnica para ello, se ha examinado el método para introducir activamente la sustancia en la célula. Por ejemplo, el E. coli que se hizo que expresara el gen lat que codifica la L-lisina 6-aminotransferasa originada a partir de la cepa IF03084 de Flavobacterium lutescens es capaz convertir L-lisina en ácido L-pipecólico (véase Literatura distinta de la de patentes 2) , y se sabe que, en la conversión microbiana que utiliza el transformante, la actividad de conversión microbiana se mejora por amplificación del gen IysP que codifica la permeasa específica de L-lisina para introducir activamente el sustrato L-lisina en la célula (véase Literatura distinta de la de patentes 3) .

Así, en la conversión... [Seguir leyendo]

1. Transformante que se puede obtener por introducción de un gen originado a partir de un organismo xerogénico que codifica cualquier enzima seleccionada del grupo que consiste en oxidorreductasa y transferasa en E. coli que es defectuoso en cualquier gen de los genes que codifican la proteína de eflujo multifármaco seleccionado del grupo que consiste en tolC y acrAB.

2. Transformante según la reivindicación 1, donde el gen originado a partir de un organismo xerogénico es un gen que codifica una enzima de citocromo P-450 o una aminotransferasa. 10

3. Transformante según la reivindicación 1, donde el gen originado a partir de un organismo xerogénico es un gen que codifica una enzima de citocromo P-450.

4. Método de conversión microbiana que utiliza el transformante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 15

5. Método de conversión microbiana según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que realiza monooxigenación a un compuesto de sustrato.

6. Método según la reivindicación 5, donde el compuesto de sustrato se selecciona del grupo que consiste en vitamina 20 D3, 4-colesten-3-ona y compactina.