Cepa productora de transglutaminasa.

Un transformante de Streptomyces mobaraensis o Streptomyces lividans,

que comprende un vector deexpresión que contiene un ADN seleccionado entre el grupo compuesto por:

(a) Un ADN que tiene una secuencia mostrada en SEC ID N.º 1 y está unido operativamente este al promotor y alterminador del gen de la transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis;

(b) Un ADN que hibrida con el ADN que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 1 en condiciones rigurosas ycodifica una proteína que tiene actividad transglutaminasa y este está unido de forma operativa a un promotor y unterminador del gen de la transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

(c) Un ADN que comprende una secuencia de bases que incluye sustitución, deleción, inserción, adición o inversiónde una o 2 a 40 bases en la secuencia de bases mostrada en la SEC ID N.º 1 y que codifica una proteína que tienela actividad transglutaminasa y este está unido de forma operativa a un promotor y un terminador del gen de latransglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

(d) Un ADN que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 2.

Cepa productora de transglutaminasa

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a una cepa que produce transglutaminasa derivada de actinomicetos y a un proceso para producir la transglutaminasa usando la cepa.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La transglutaminasa es una enzima que cataliza una reacción de transferencia de acilo de un grupo y-carboxamida de un resto de glutamina en una cadena peptídica. En particular, la transglutaminasa induce la formación intramolecular o intermolecular de entrecruzamiento e- (y-Gln) -Lys a un grupo e-amino de un resto de lisina en una proteína. La enzima ha sido ampliamente utilizada para el procesamiento de proteínas usando esta propiedad en los campos de la alimentación y la medicina.

Desde hace mucho tiempo se conoce la transglutaminasa derivada de animales. Se ha publicado que se han encontrado transglutaminasas en animales, por ejemplo, en el hígado de cobayas y en órganos y en la 20 sangre de mamíferos (Connellan y col., Journal of Biological Chemistr y , vol. 246, N.º 4, pág. 1093-1098 (1971) ) , Folk y col., Advances in Enzymology, vol. 38, pág. 109-191 (1973) ) y Folk y col., Advances in Protein Chemistr y , vol. 31, pág. 1-133 (1977) ) y se han estudiado sus propiedades enzimáticas. Por otro lado, se ha encontrado un tipo diferente de transglutaminasa que no es dependiente de calcio (Ca2+) y es, por tanto, diferente de la transglutaminasa derivada de animales mencionada anteriormente. Específicamente, se ha aislado e identificado una transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis [nombre anterior: Sireptoverticillium mobaraense] IFO 13819 (publicación de patente japonesa sin examinar N.º S64-27471) , de Streptomyces griseocarneus [nombre anterior: Streptoverticillium griseocarneum) ] IFO 12776 y de Streptomyces cinnamoneus) [nombre anterior: Streptoverticillium cinnamoneum) ] IFO 12852 (publicación de patente japonesa sin examinar N.º 2001186884) , etc.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Convencionalmente, puesto que la transglutaminasa se ha producido mediante extracción y aislamiento, etc., a partir de animales, microorganismos y similares, que están presentes en la naturaleza, hay 35 muchos problemas que resolver como un bajo rendimiento de producción y un coste de producción caro, etc. Entre tanto, para la transglutaminasa derivada de microorganismos se ha estudiado intensamente el proceso de producción usando recombinación genética. Por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 1 225 217 A1 se describe un procedimiento de producción secretora de transglutaminasa mediante un microorganismo usando un plásmido de expresión que contiene un gen de transglutaminasa de una bacteria Streptomyces bajo el control de su 40 promotor nativo. De forma similar, en la solicitud de patente europea EP 0 481 504 se describe la clonación del gen de la transglutaminasa a partir de Streptoverticillium sp., y la expresión recombinante de la enzima en un huésped microbiano. Sin embargo, según la primera publicación de un proceso usando recombinación genética (Biosci. Biotech. Biochem., 58, 82-87 (1994) , publicación de patente japonesa sin examinar N.º His-199883) , la cantidad de producción fue de aproximadamente 0, 1 mg/l, lo que estaba lejos del nivel de producción industrial. Además, según 45 la notificación reciente (publicación de patente japonesa sin examinar N.º 2001-186884) aunque el nivel de producción se mejoró en cierto grado, el cultivo microbiano de dos semanas dio lugar a una productividad de sólo aproximadamente 40 a 50 mg/l. En este caso, tampoco puede decirse que se obtuviera una productividad suficiente.

La presente invención se hizo en base a los antecedentes mencionados anteriormente y el objeto 50 de la presente invención es proporcionar una cepa capaz de producir transglutaminasa con una alta eficacia y un proceso para producir la transglutaminasa usando la cepa.

Para solucionar los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores han investigado con avidez. Esto significa que, para expresar la transglutaminasa derivada de actinomicetos, los 55 presentes inventores han investigado la combinación de un gen estructural de la transglutaminasa, un promotor, un vector y un huésped actinomiceto. Como resultado, los presentes inventores han obtenido con éxito un transformante que tiene una productividad extremadamente alta de transglutaminasa y han completado la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. En esta se describe:

[1] Un transformante de Streptomyces mobaraensis, que comprende un gen estructural de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis y un promotor y un terminador que actúan sobre el gen estructural los cuales se introducen de forma externa.

[2] El transformante de Streptomyces mobaraensis según [1], en el que el promotor es un promotor de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

[3] El transformante de Streptomyces mobaraensis descrito en [1] o [2], en el que el terminador es un terminador de 10 transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

[4] El transformante de Streptomyces mobaraensis descrito en cualquiera de los puntos [1] a [3], en el que el gen estructural comprende una secuencia mostrada en la SEC ID N.º 1 o una secuencia obtenida modificando una parte de la secuencia, codificando la secuencia la transglutaminasa.

[5] Un transformante de Streptomyces mobaraensis que comprende un fragmento de ADN que tiene una secuencia introducida de forma externa mostrada en la SEC ID N.º 2 o una secuencia obtenida modificando una parte de la secuencia, codificando la secuencia la transglutaminasa.

[6] El transformante de Streptomyces mobaraensis descrito en cualquiera de los puntos [1] a [5], que es un transformante de Streptomyces mobaraensis S-8112 o una cepa mutante del mismo.

[7] Un proceso para la producción de transglutaminasa que comprende las etapas de:

cultivar el transformante de Streptomyces mobaraensis que comprende un gen estructural de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis y un promotor y un terminador que actúan sobre el gen estructural y que se introducen de forma externa, en las condiciones en las que el gen estructural puede expresarse y recoger la transglutaminasa producida.

[8] El transformante de Streptomyces mobaraensis según [7], en el que el promotor es un promotor de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

[9] El proceso para la producción de transglutaminasa descrito en los puntos [7] u [8], en el que el terminador es un terminador de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis. 35

[10] El proceso para la producción de transglutaminasa en cualquiera de los puntos [7] a [9], en el que el gen estructural comprende una secuencia mostrada en la SEC ID N.º 1 o una secuencia obtenida modificando una parte de la secuencia, codificando la secuencia la transglutaminasa.

[11] El proceso para la producción de transglutaminasa descrito en cualquiera de los puntos [7] a [9], en el que el transformante de Streptomyces mobaraensis comprende un fragmento de ADN que tiene una secuencia introducida de forma externa mostrada en la SEC ID N.º 2 o una secuencia obtenida modificando una parte de la secuencia, codificando la secuencia la transglutaminasa.

[12] El proceso para la producción de transglutaminasa descrito en cualquiera de los puntos [7] a [11], en el que el transformante de Streptomyces mobaraensis es un transformante de Streptomyces mobaraensis S-8112 o una cepa mutante del mismo.

[13] Un transformante de Streptomyces lividans que comprende un gen estructural de transglutaminasa derivado de 50 Streptomyces mobaraensis y un promotor y un terminador que actúan sobre el gen estructural los cuales se introducen de forma externa.

[14] El transformante de Streptomyces lividans descrito en el punto [13], en el que el promotor es un promotor de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis. 55

[15] El transformante de Streptomyces lividans descrito en el punto [13] o [14], en el que el terminador es un terminador de transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

[16] El transformante de Streptomyces lividans descrito en cualquier de los puntos [13] a [15], en el que el gen estructural comprende una secuencia mostrada en la SEC ID N.º 1 o una secuencia obtenida modificando una parte de la secuencia, codificando la secuencia la transglutaminasa.

[17] Un transformante de Streptomyces lividans que comprende un fragmento de ADN que tiene una secuencia introducida de forma externa mostrada en la SEC ID N.º 2 o una secuencia obtenida modificando una parte de la... [Seguir leyendo]

1. Un transformante de Streptomyces mobaraensis o Streptomyces lividans, que comprende un vector de expresión que contiene un ADN seleccionado entre el grupo compuesto por: 5

(a) Un ADN que tiene una secuencia mostrada en SEC ID N.º 1 y está unido operativamente este al promotor y al terminador del gen de la transglutaminasa de Streptomyces mobaraensis;

(b) Un ADN que hibrida con el ADN que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 1 en condiciones rigurosas y

codifica una proteína que tiene actividad transglutaminasa y este está unido de forma operativa a un promotor y un terminador del gen de la transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

(c) Un ADN que comprende una secuencia de bases que incluye sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de una o 2 a 40 bases en la secuencia de bases mostrada en la SEC ID N.º 1 y que codifica una proteína que tiene la actividad transglutaminasa y este está unido de forma operativa a un promotor y un terminador del gen de la transglutaminasa derivado de Streptomyces mobaraensis.

(d) Un ADN que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 2;

2. El transformante según la reivindicación 1, el cual es

(a) un transformante de Streptomyces mobaraensis S-8112 o

(b) un transformante de Streptomyces lividans 3131. 25

3. Un proceso para la producción de transglutaminasa que comprende las etapas de:

(a) cultivar el transformante según la reivindicación 1 o 2 en las condiciones en que el gen estructural que codifica la transglutaminasa pueda expresarse y 30

(b) recoger la transglutaminasa producida.