Cepa de Escherichia capaz de convertir el XMP en GMP y de mantener el estado inactivado del gen o de los genes asociados a la degradación del GMP y procedimientos para utilizarla.

Cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 de n.

º de acceso KCCM-10536 yque comprende un gen deoD inactivado, un gen aphA inactivado y un gen appA inactivado.

Cepa de Escherichia capaz de convertir el XMP en GMP y de mantener el estado inactivado del gen o de los genes asociados a la degradación del GMP y procedimientos para utilizarla

Campo técnico

La presente invención se refiere a una cepa de Escherichia capaz de convertir el ácido 5'-xantílico (XMP) en el ácido 5'-guanílico (GMP) y de mantener el estado inactivado de un gen o genes asociados a la degradación del GMP, y procedimientos para utilizarla.

Antecedentes de la técnica El ácido 5'-guanílico (GMP) se puede producir mediante la degradación enzimática microbiana o química del ARN de levadura, la fermentación directa para producir directamente nucleótidos mediante cepas mutantes cultivadas en medios que contienen un azúcar, una fuente de nitrógeno y una fuente de fosfato, o un procedimiento de combinación que incluye la síntesis fermentativa de intermedios de los nucleótidos y la conversión química o enzimática de los intermedios de los nucleótidos en nucleótidos. Debido a sus ventajas económicas, en los últimos años se utiliza mucho en la industria un procedimiento de combinación que combina la síntesis fermentativa o química y la conversión enzimática.

La producción de GMP mediante el procedimiento de combinación consiste en la síntesis fermentativa del ácido 5'xantílico (XMP) y la conversión enzimática del XMP en GMP. En la actualidad se utilizan dos tipos de cepas microbianas. Es decir, se utiliza una cepa que produce XMP para la síntesis fermentativa y, para la conversión enzimática, se utiliza una cepa microbiana capaz de inducir una sobreexpresión continua de un gen que codifica la 20 actividad XMP aminasa. En este caso, la tasa de supervivencia de la cepa microbiana utilizada para la conversión enzimática se reduce considerablemente durante un periodo de cultivo posterior respecto a durante un periodo de cultivo inicial, con lo que disminuye la producción de GMP. Además, se sabe que el gen guaA que codifica la XMP aminasa es mortal para las células hospedadoras y, así pues, la sobreexpresión continua de la XMP aminasa dificulta el crecimiento de la cepa microbiana utilizada en la conversión enzimática durante el periodo de cultivo posterior. Además, se sabe que se expresa un gen interno responsable de la degradación del GMP en la cepa microbiana utilizada para la conversión enzimática, lo que facilita la degradación del GMP.

En vista de los problemas anteriores, los presentes inventores desarrollaron la cepa de Escherichia sp. GPD1114 (n.º de acceso KCCM-10543) que incluye un gen que codifica la XMP aminasa capaz de expresar la XMP aminasa de acuerdo con el estado de crecimiento celular y la inactivación de un gen glnL interno. Además, los presentes inventores desarrollaron la cepa de Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) a partir de Escherichia sp. GPD1114, en la que el gen ushA que codifica la 5'-nucleotidasa está inactivado para eliminar la degradación del GMP.

No obstante, ya que Escherichia sp. GPU1114 todavía contiene genes internos relacionados con la degradación del GMP, excepto el gen ushA que codifica la 5'-nucleotidasa, el GMP se puede degradar en guanosina o guanina. Por

lo tanto, en la técnica se necesita una cepa microbiana con inactivación simultánea de todos los genes asociados a la degradación del GMP.

La patente europea EP 1170370 describe un procedimiento para producir un nucleótido por fermentación. El éster 5'fosfato de nucleósido se produce con el cultivo de una bacteria que pertenece al género Escherichia, que tiene la capacidad de producir el éster 5'-fosfato de nucleósido, en un medio para producir y acumular el éster 5'-fosfato de nucleósido en el medio y recoger el éster 5'-fosfato de nucleósido del medio. El gen ushA y los genes aphA de la bacteria no suelen estar funcionales.

La patente europea EP 1004663 describe un proceso para producir nucleósidos de purina por fermentación. El proceso comprende cruzar y cultivar microorganismos que tienen un gen que codifica una enzima, en donde la inhibición por retroalimentación se ha mitigado sustancialmente mediante una serie de modificaciones en el 45 microorganismo. Estas modificaciones incluyen la sustitución de uno o dos restos aminoacídicos en la fosforribosilpirofosfato (PRPP) amidotransferasa codificada por el gen purF de Escherichia coli. El microorganismo también comprende la inactivación de un gen que codifica una proteína que es el represor del sistema de biosíntesis de los nucleótidos de purina codificado por purR, la inactivación de un gen que codifica una enzima que es la fosforilasa de nucleósidos de purina codificada por deoD, la inactivación de un gen que codifica una enzima que es 50 la succinil-AMP sintasa codificada por purA, la inactivación de un gen que codifica una enzima que es la 6fosfogluconato deshidratasa codificada por edd y la inactivación de un gen que codifica una enzima que es la fosfoglucosa isomerasa codificada por pgi, o similares.

Descripción de la invención Problema técnico La presente invención da a conocer una cepa microbiana capaz de convertir el ácido 5'-xantílico (XMP) en ácido 5'guanílico (GMP) y de mantener el estado inactivado de un gen o genes internos relacionados con la degradación del 5 GMP.

La presente invención también da a conocer un procedimiento para acumular la GMP sintetasa a una concentración elevada en un medio de cultivo gracias al uso de la cepa microbiana.

La presente invención también da a conocer un procedimiento para producir GMP, 5'-difosfato de guanosina (GDP) ,

o 5'-trifosfato de guanosina (GTP) gracias al uso de la cepa microbiana.

Solución técnica La presente invención da a conocer una cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) e incluye un gen deoD inactivado, un gen aphA inactivado y un gen appA inactivado.

La cepa madre, Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) es una cepa de Escherichia coli (E. coli) en la que está inactivado el gen glnL, está insertado por transformación el gen guaA que codifica la aminasa del ácido 5'-xantílico (XMP) , y está inactivado un gen ushA interno que codifica la 5'-nucleotidasa. En la Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) hay una elevada tasa de conversión de XMP en ácido 5'-guanílico (GMP) gracias a la expresión del gen guaA, y como la actividad de degradación del GMP es baja debido a que no se expresa el gen ushA, se incrementa la productividad del GMP.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el gen deoD no está limitado siempre y cuando sea un gen que codifica la actividad de la fosforilasa de nucleósidos de purina. Por ejemplo, el gen deoD puede ser el de n.º de acceso del NCBI NP_418801, pero la presente invención no se limita a éste. Así pues, el gen deoD significa que se abarca un gen de tipo silvestre y un gen mutante natural o artificial de deoD.

También se describe en la presente memoria una cepa de Escherichia que es E. coli DKO-ud (n.º de acceso KCCM10633) .

También se describe en la presente memoria una cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) y que incluye los genes deoD y aphA inactivados.

El gen aphA no está limitado siempre y cuando sea un gen que codifique la actividad de fosfatasa ácida. Por ejemplo, el gen aphA puede ser el de n.º de acceso del NCBI NP_418479, pero la presente invención no se limita a éste. Así pues, el gen aphA significa que se abarca un gen de tipo silvestre y un gen mutante artificial o natural de aphA.

También se describe en la presente memoria una cepa de Escherichia que es E. coli TKO-udh (n.º de acceso KCCM-10631) .

La presente invención también da a conocer una cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) y que incluye los genes deoD, aphA y appA inactivados.

El gen appA no está limitado siempre y cuando sea un gen que codifique la actividad de (poli) fosfatasa ácida. Por ejemplo, el gen appA puede ser el de n.º de acceso del NCBI NP_415500, pero la presente invención no se limita a éste. Así pues, el gen appA significa que se abarca un gen del tipo silvestre y un gen mutante artificial o natural de appA.

La cepa de Escherichia de la presente invención puede ser E. coli QKO-udhp (n.º de acceso KCCM-10632) .

La presente invención también da a conocer una cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 (n.º de acceso KCCM-10536) y que incluye los genes deoD, aphA, appA y hprt inactivados.

El gen hprt no está limitado siempre y cuando sea un gen que codifique la hipoxantina fosforirribosiltransferasa. Por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Cepa del género Escherichia que procede de Escherichia sp. GPU1114 de n.º de acceso KCCM-10536 y que comprende un gen deoD inactivado, un gen aphA inactivado y un gen appA inactivado.

2. Cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el producto del gen deoD tiene la secuencia presentada 5 en NP_418801 descrita en la página 3 de la descripción.

3. Cepa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el producto del gen aphA tiene la secuencia presentada en NP_418479 descrita en la página 3a de la descripción (página 4 de la traducción) .

4. Cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el producto del gen appA tiene la secuencia presentada en NP_415500 descrita en la página 3a de la descripción (página 4 de la traducción) .

5. Cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es Escherichia sp. QKO-udhp de n.º de acceso KCCM-10632.

6. Cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el gen hprt también está inactivado.

7. Cepa de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el producto del gen hprt tiene la secuencia presentada 15 en NP_414667 descrita en la página 3a de la descripción (página 4 de la traducción) .

8. Cepa de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que es Escherichia sp. QIKO de n.º de acceso KCCM-10630.

9. Cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los genes deoD, aphA, appA y hprt están inactivados cada uno mediante sustitución por recombinación homóloga.

10. Procedimiento para acumular l.

5. guanilato (GMP) sintetasa en las células, en donde el procedimiento comprende el cultivo de la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Procedimiento para producir GMP.

5. difosfato de guanosina (GDP) .

5. trifosfato de guanosina (GTP) , en donde el procedimiento comprende el cultivo de la cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.