Células madre CD34- mesenquimales para su uso en terapia génica de cicatrización de heridas.

Células madre CD34- genéticamente modificadas, conteniendo cada una de las células madre CD34-genéticamente modificadas un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica para una proteínaque potencia el crecimiento de células endoteliales,

región que está operativamente unida a (ii) un promotorespecífico de endotelio o combinación de promotor/potenciador para el uso en la mejora de la microcirculación y/ocicatrización de heridas aguda en un sujeto que está a punto de someterse a, está sometiéndose a o se ha sometidoa cirugía o un traumatismo físico en el que la introducción de las células madre CD34- genéticamente modificadas enel torrente sanguíneo del sujeto no se ve precedida, acompañada o seguida por mieloablación,

siendo el traumatismo físico un parto, o

siendo el traumatismo físico una herida superficial provocada por un acto violento, y las células madre CD34-genéticamente modificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismofísico, o siendo el traumatismo físico una herida por quemadura, y las células madre CD34- genéticamentemodificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismo físico.

Células madre CD34- mesenquimales para su uso en terapia génica de cicatrización de heridas Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención Las células madre median en la reproducción y transmisión de información genética a generaciones celulares posteriores. Pueden autorrenovarse y generar progenie diferenciada. En los últimos años se ha progresado en la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre células madre y sus nichos tisulares. Esto ha conducido a una mejor comprensión de los mecanismos reguladores moleculares en funcionamiento en células madre.

Aunque la terapia génica está todavía en un enfoque experimental, la tecnología promete tener un impacto sobre la salud humana. El alcance y la definición de la terapia génica han cambiado y se han expandido a lo largo de los últimos pocos años. Además de corregir trastornos genéticos heredados tales como fibrosis quística, hemofilia y otras entidades, también están desarrollándose enfoques de terapia génica para combatir enfermedades adquiridas tales como cáncer, SIDA, isquemia vascular crónica, osteoartritis, diabetes, enfermedad de Parkinson y de Alzheimer.

En la actualidad, no está contemplándose la terapia génica de la línea germinal debido a su naturaleza técnica completa y consideraciones éticas. Sin embargo, la terapia génica de células somáticas exclusivamente para el beneficio de un individuo (que no puede pasarse a generaciones subsiguientes) es un foco principal de la investigación en células madre. Ha llevado más de 15 años de esfuerzo desde la descripción inicial de la transferencia génica satisfactoria a células madre hematopoyéticas murinas hasta los primeros ensayos clínicos inequívocamente satisfactorios en pacientes nacidos con inmunodeficiencia combinada ligada al cromosoma X (SCID) y deficiencia en adenosina desaminasa (ADA) (Aiuti et al., 2002; Cavazzana-Calvo et al., 2000; Gaspar et al., 2004) . Están explorándose muchos aspectos de la terapia con células madre. Por ejemplo, se han usado vectores retrovirales en muchas situaciones para la transferencia de genes a células madre para reparar genes mutados o incompletos. Estos incluyen deficiencia inmunitarias combinadas graves, anemia de Fanconi y otras hemoglobinopatías (Herzog et al., 2006) .

Un problema central en la modificación por ingeniería genética de células madre es la metodología específica usada para introducir genes terapéuticos en las células progenitoras. Debido a que los retrovirus tienden a insertarse en genes activos (se cree la cromatina condensada se abre en estas regiones) , se ha sugerido que su uso puede aumentar también el riesgo de cáncer (Young et al., 2006) , porque la inserción de vectores retrovirales próximos a genes implicados en proliferación celular podría generar en teoría una célula madre cancerosa precursora. Sin embargo, el riesgo global de este tipo de acontecimiento es difícil de establecer. Hay ahora muchos ejemplos de éxito completo logrado en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD) en los que se restauró la actividad NADPH oxidasa tras la infusión de células madre sanguíneas genéticamente alteradas (Barese et al., 2004) .

El requisito mínimo para lograr una terapia génica productiva es la producción sostenida del producto génico terapéutico en el contexto biológico correcto con efectos secundarios perjudiciales mínimos. Para lograr este fin, la aplicación de células madre en terapia génica requerirá el desarrollo de nuevas estrategias para modular la expresión de genes terapéuticos, así como métodos para el suministro eficaz de genes foráneos a células madre. El control selectivo de la expresión de genes terapéuticos por células madre en diferenciación dentro de un entorno tisular definido es un importante objetivo en la modificación por ingeniería genética de células madre. Este enfoque podría ayudar, por ejemplo, en el control de la diferenciación de células madre para dar linajes específicos, el mantenimiento de su estado no diferenciado para su posterior trasplante, proliferación y regulación de la expresión de genes terapéuticos tales como genes suicidas, citocinas o factores de crecimiento en entornos tisulares definidos.

Sumario de la invención Esta invención proporciona células madre CD34- genéticamente modificadas, en la que cada una de las células madre CD34- genéticamente modificadas contiene un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica para una proteína que potencia el crecimiento de células endoteliales, región que está operativamente unida a (ii) un promotor específico de endotelio o combinación de promotor/potenciador para el uso en la mejora de la microcirculación y/o cicatrización de heridas aguda en un sujeto que está a punto de someterse a, está sometiéndose a o se ha sometido a cirugía o un traumatismo físico en el que la introducción de las células madre CD34- genéticamente modificadas en el torrente sanguíneo del sujeto no se ve precedida, acompañada o seguida por mieloablación, siendo el traumatismo físico un parto, o siendo el traumatismo físico una herida superficial provocada por un acto violento, y las células madre CD34-genéticamente modificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismo físico, o siendo el traumatismo físico una herida por quemadura, y las células madre CD34- genéticamente modificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismo físico.

Otros objetos y características de la presente invención y ejemplos comparativos resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada considerada conjuntamente con los dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que los dibujos están diseñados únicamente para fines de ilustración y no como una definición de los límites de la invención, para los que debe hacerse referencia a las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse además que los dibujos no están necesariamente dibujados a escala y que, a menos que se indique lo contrario, están destinados meramente a ilustrar conceptualmente las estructuras y los procedimientos descritos en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos En los dibujos:

Figura 1

Fila superior: expresión de insulina en un islote β murino normal antes (izquierda) y después del tratamiento con aloxano (ALX) (derecha) con agotamiento de la insulina casi completo. Fila inferior: tamaño de un islote β normal que produce insulina a diferentes aumentos (20x; 40x) ; el tratamiento del islote β agotado en insulina tras el tratamiento con ALX con células madre negativas para CD34 (SC) restaura completamente la producción de insulina con signos de hipertrofia (20x y 40x) .

Figura 2

Células aisladas de un páncreas murino tras la diabetes inducida por ALX y la restauración con SC de la producción de insulina. Se marcaron las células madre negativas para CD34 trasplantadas con una proteína fluorescente verde expresada de manera constitutiva y las células que producían insulina mostraban una fluorescencia roja. No hubo expresión conjunta de ambos marcadores, lo que sugiere que las células madres trasplantadas no expresan insulina por sí misma sino que más bien facilitan la regeneración endógena.

Figura 3

Izquierda: Niveles de glucemia de ratones tras el tratamiento con ALX sin trasplante de SC (parte superior) , con trasplante de SC y sin corrección del nivel de glucemia (parte media) y ratones con un nivel de glucemia normalizado tras el trasplante de SC (parte inferior) . Derecha: Sólo los ratones que revelaron la presencia de células madre en sus páncreas (homogeneizados para el análisis de FACS y la detección de la fluorescencia verde) (E3; círculo de color rojo) mostraron un nivel de glucemia normalizado, lo que sugiere el papel fundamental de las células trasplantadas en la corrección de la producción de insulina.

Figura 4

Presentación esquemática del desarrollo de un tumor maligno epitelial desde un carcinoma in situ hasta cáncer invasivo y la conexión con el sistema de vasos sanguíneos endógenos. Las células madre negativas para CD34 se dirigen a un sitio de neo-angiogénesis tal como se demuestra en el presente documento y por tanto pueden utilizarse como caballo de Troya para suministrar agentes moduladores inmunitarios o citotóxicos.

Figura 5

Detección de células positivas para RFP en tumores mamarios. Células madre transfectadas con Tie2-RFP se diferencian a endoteliales y transcriben el RFP. (A) Contrateñidas con DAPI. (B) Células positivas para RFP que forman vasos.

Figura 6

Reducción de la... [Seguir leyendo]

1. Células madre CD34- genéticamente modificadas, conteniendo cada una de las células madre CD34genéticamente modificadas un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica para una proteína que potencia el crecimiento de células endoteliales, región que está operativamente unida a (ii) un promotor específico de endotelio o combinación de promotor/potenciador para el uso en la mejora de la microcirculación y/o cicatrización de heridas aguda en un sujeto que está a punto de someterse a, está sometiéndose a o se ha sometido a cirugía o un traumatismo físico en el que la introducción de las células madre CD34-genéticamente modificadas en el torrente sanguíneo del sujeto no se ve precedida, acompañada o seguida por mieloablación,

siendo el traumatismo físico un parto, o siendo el traumatismo físico una herida superficial provocada por un acto violento, y las células madre CD34genéticamente modificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismo físico, o siendo el traumatismo físico una herida por quemadura, y las células madre CD34- genéticamente modificadas se introducen en el torrente sanguíneo del sujeto inmediatamente tras el traumatismo físico.

2. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según la reivindicación 1, siendo el sujeto un ser humano.

3. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la cirugía cirugía abdominal, cirugía torácica, neurocirugía o cirugía plástica.

4. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la cirugía cirugía laparoscópica.

5. Células madre CD34-genéticamente modificadas para el uso según las reivindicaciones 1 a 3, siendo la cirugía cirugía abierta.

6. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la combinación de promotor/potenciador el promotor/potenciador Tie2 y siendo la proteína que potencia el crecimiento de células endoteliales un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) asociado con angiogénesis.

7. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo las células madre CD34- genéticamente modificadas alogénicas con respecto al sujeto.

8. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, siendo las células madre CD34- genéticamente modificadas autólogas con respecto al sujeto.

9. Células madre CD34- genéticamente modificadas para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo el número terapéuticamente eficaz de células madre CD34- genéticamente modificadas de desde 1 x 103 hasta 1 x 107 células/kg de peso corporal.