Blastocitos CD34 mesenquimales para uso en terapia génica de diabetes.

Blastocitos mesenquimales CD34 genéticamente modificados, en donde cada uno de los blastocitos CD34 genéticamente modificados contiene un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica una proteína que mejora el crecimiento celular endotelial,

cuya región se liga funcionalmente a (ii) un promotor específico de endotelio o combinación de promotor/mejorador para el uso en tratar un sujeto diabético o prediabético en donde la introducción de los blastocitos CD34 genéticamente modificados dentro del torrente sanguíneo del sujeto no está precedido, acompañado o seguido por mieloablación.

Blastocitos CD34 mesenquimales para uso en terapia génica de diabetes Antecedentes de la invención 1. Campo de la Invención A través de esta solicitud, se citan diversas publicaciones. La descripción de estas publicaciones, así como también de las solicitudes provisionales identificadas previamente, se utiliza para describir el estado más completo de la técnica a la que pertenece esta invención.

Los blastocitos son mediadores en la reproducción y transmisión de la información genética a generaciones celulares posteriores. Estos se pueden auto-renovar y generar progenie diferenciada. En años recientes se han hecho progresos en nuestra compresión de los mecanismos moleculares que subyacen en las interacciones entre los blastocitos y sus nichos de tejido. Esto ha conducido a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares reguladores en la función de los blastocitos.

Aunque la terapia génica es aún un método experimental, la tecnología promete hacer un impacto en la salud humana. El alcance y definición de la terapia génica ha cambiado y se ha expandido en años recientes. Además de los trastornos genéticos correctamente heredados tal como fibrosis quística, hemofilia y otras enfermedades, también se han desarrollado métodos de terapia génica para combatir las enfermedades adquiridas tal como cáncer, SIDA, isquemia crónica vascular, osteoartritis, diabetes, enfermedad de Parkinson y Alzheimer.

Actualmente, la terapia génica de estirpe reproductora no se contempla debido a su naturaleza técnica y consideraciones éticas. Sin embargo, la terapia génica de células somáticas exclusivamente para el beneficio de un individuo (que no se puede pasar en generaciones sucesivas) es un foco principal de la investigación de blastocitos. Durante 15 años se ha hecho un esfuerzo de descripción inicial de transferencia génica exitosa en blastocitos hematopoyéticos de murino, a los primeros ensayos clínicos no ambiguamente exitosos en pacientes nacidos con inmunodeficiencia combinada ligada a x (SCID) y deficiencia de desaminasa adenosina (ADA) (Aiuti et al., 2002; Cavazzana-Calvo et al., 2000; Gaspar et al., 2004) . Se exploran muchos aspectos de la terapia de blastocitos. Por ejemplo, se han utilizado vectores retrovíricos en muchas configuraciones para la transferencia de genes en los blastocitos para reparar genes incompletos o mutados. Estos incluyen severas deficiencias inmunes combinadas, anemia Fanconi y otras hemoglobinopatías (Herzog et al., 2006) .

Un tema central en la ingeniería genética de los blastocitos es la metodología específica utilizada para introducir genes terapéuticos en las células progenitoras. Debido a que los retrovirus tienden a insertarse en los genes activos (se considera que la cromatina condensada se abre en estas regiones) , se ha sugerido que su uso también puede aumentar el riesgo de cáncer (Young et al., 2006) , debido a que la inserción de los factores retrovíricos cercanos a los genes implicados en la proliferación celular puede en teoría generar un blastocito precursor de cáncer. Sin embargo, el riesgo general de este tipo de evento es difícil de establecer. Ahora existen muchos ejemplos de éxito completo logrado en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD) en donde la actividad de oxidasa NADPH se restaura luego de la infusión de los blastocitos sanguíneos alterados genéticamente (Barese et al., 2004) .

El requerimiento mínimo para la terapia génica productiva es la producción sostenida del producto génico terapéutico en el contexto biológico correcto con mínimos efectos colaterales perjudiciales. Para lograr este fin, la aplicación de los blastocitos en terapia genética requerirá el desarrollo de nuevas estrategias para modular la expresión terapéutica del gen, así como también métodos para el suministro eficiente de genes exógenos en los blastocitos. El control selectivo de la expresión terapéutica del gen al diferenciar los blastocitos dentro de un ambiente de tejido definido es un objetivo importante en la ingeniería de los blastocitos. Este método, por ejemplo, puede ayudar en el control de la diferencia de los blastocitos en linajes específicos, el mantenimiento de su estado no diferenciado para trasplante final, proliferación, y la regulación de la expresión de genes terapéuticos tal como genes suicidas, citoquinas o factores de crecimiento en ambientes de tejido definidos.

Resumen de la invención Esta invención proporciona blastocitos CD34 genéticamente modificados, en donde cada uno de los blastocitos CD34 genéticamente modificados contiene un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica una proteína que mejora el crecimiento celular endotelial, cuya región se liga funcionalmente a (ii) un promotor específico de endotelio o combinación de promotor/mejorador para el uso en el tratamiento de un sujeto diabético o prediabético en donde la introducción de los blastocitos CD34 genéticamente modificados dentro del torrente sanguíneo del sujeto no está precedido, acompañado o seguido por mieloablación.

Otros objetos y características de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada considerado en conjunto con los dibujos que acompañan. Se entiende, sin embargo, que los dibujos se diseñan únicamente para propósitos de ilustración y no como una definición de los límites de la invención, para los que se puede hacer referencia a las reivindicaciones adjuntas. Se entiende adicionalmente que los dibujos no se grafican necesariamente a escala y que, a menos que se indique otra cosa pretenden únicamente ilustrar conceptualmente las estructuras y procedimientos descritos aquí.

Breve descripción de los dibujos En los dibujos:

Figura 1

Fila superior: expresión de insulina en un islote ß de murino normal antes (izquierda) y después de tratamiento de aloxano (ALX) (derecha) con casi agotamiento de insulina completo. Fila inferior: tamaño de un islote ß que produce insulina normal en diferente magnificación (20x; 40x) ; el tratamiento de islote ß agotada de insulina después del tratamiento ALX con blastocitos negativos CD34 (SC) restaura completamente la producción de insulina con signos de hipertrofia (20x y 40x) .

Figura 2

Células aisladas de páncreas de murino después de diabetes inducida por ALX y restauración SC de la producción de insulina. Los blastocitos negativos CD34 trasplantados se marcan con una proteína fluorescente verde expresada constitutivamente, y las células que producen insulina muestran una fluorescencia roja. No existe co-expresión de ambos marcadores, lo que sugiere que los blastocitos trasplantados no expresan insulina en sí mismos pero a diferencia facilitan la regeneración endógena.

Figura 3

Izquierda: Niveles de glucosa en sangre de los ratones después de tratamiento ALX sin trasplante SC (superior) , con trasplante SC y sin corrección del nivel de glucosa en sangre (medio) y ratones con un nivel de glucosa en sangre normalizado después de trasplante SC (inferior) . Derecha: Solo ratones que revelan la presencia de blastocitos en su páncreas (homogenizado para análisis FACS y detección de fluorescencia verde) (E3; círculo rojo) muestra un nivel de glucosa en sangre normalizado, que sugiere la función pivote de células trasplantadas en la corrección de la producción de insulina.

Figura 4

Presentación esquemática del desarrollo de un cáncer epitelial de un carcinoma in-situ en cáncer invasivo y la conexión al sistema de vaso sanguíneo endógeno. Los blastocitos negativos CD34 buscan un sitio de neoangiogenia como se demuestra aquí y por lo tanto se pueden utilizar como Caballo de Troya para suministrar agentes moduladores inmunes o citotóxicos.

Figura 5

Detección de células positivas RFP en tumores mamarios. Los blastocitos transfectados Tie2-RFP se diferencian de células endoteliales y transcriben el RFP. (A) Contrateñido con DAPI. (B) células positivas RFP que forman vasos.

Figura 6

Evolución de tumor reducida bajo tratamiento GCV. (A) Protocolo de aplicación GCV de blastocitos. La suspensión celular (día 0) y la solución GCV (día 5-8) respectivamente se aplican como se muestra. El aumento de peso corporal durante el tratamiento de ratones refleja la carga de tumor total cuando se involucran todas las mamas. El peso corporal se mide en el día 0 y 5 de cada ciclo de terapia y el día de disección. (B) Grupos de ratones, el tratamiento inicia en la semana 22, que muestra la desviación estándar y promedio. Los ratones se clasifican en un grupo de tratamiento y dos grupos de control. El primer grupo de control recibió 1xPBS en lugar de una suspensión de blastocitos... [Seguir leyendo]

1. Blastocitos mesenquimales CD34 genéticamente modificados, en donde cada uno de los blastocitos CD34 genéticamente modificados contiene un ácido nucleico exógeno que comprende (i) una región que codifica una proteína que mejora el crecimiento celular endotelial, cuya región se liga funcionalmente a (ii) un promotor específico de endotelio o combinación de promotor/mejorador para el uso en tratar un sujeto diabético o prediabético en donde la introducción de los blastocitos CD34 genéticamente modificados dentro del torrente sanguíneo del sujeto no está precedido, acompañado o seguido por mieloablación.

2. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto es humano.

3. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

o 2, en donde el sujeto es pre-diabético.

4. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con la reivindicación previa, en donde el sujeto pre-diabético es pre-diabético para diabetes tipo I.

5. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el sujeto pre-diabético es pre-diabético para diabetes tipo II.

6. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el sujeto es diabético.

7. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el sujeto diabético está afectado con diabetes tipo I.

8. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el sujeto diabético está afectado con diabetes tipo II.

9. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la combinación de promotor/mejorador es el promotor/mejorador Tie2 y la proteína que mejora el crecimiento celular endotelial es un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) asociado con angiogenia.

10. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los blastocitos CD34 genéticamente modificados son alogénicos con respecto al sujeto.

11. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 9, en donde los blastocitos CD34 genéticamente modificados son autólogos con respecto al sujeto.

12. Los blastocitos CD34 genéticamente modificados para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el número terapéuticamente efectivo de blastocitos CD34 genéticamente modificados es de 1 x 103 a 1 x 107 células/kg de peso corporal.

RATÓN NO TRATADO ALX + RATÒN NORMALIZADO Rm26

FIGURA 2

FIGURA 5

EDAD [SEMANAS]

CONTROL DE MAMA NORMAL CONTROL DE TUMOR DE MAMA

CONTROL DE TUMOR -ADICIÓN DETRATADOS POR 4 SEMANAS (18 - 22) CONTROL imMSC CON imMSC/TK + GV I.V.

FIGURA 9

MSC diseñado con ingeniería para expresar GFP bajo el control del promotor CMV, hogar de la inyección i.v.

MSC diseñado con ingenieria para expresar RFP bajo el control del Tie2