Célula transformada por el gen WNT3A humano.

Una célula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano,

en donde dicha célula es seleccionada de un grupo que consiste en células procedentes de folículos pilosos, en donde dichas células procedentes de folículos pilosos son células inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS) o células inmortalizadas de papila dérmica (IDP), y células procedentes de cáncer de próstata que son células de cáncer de próstata humano (PC3).

Celula transformada por el gen WNT3A humano

Campo tecnico La presente invencion proporciona una celula transformada con un vector que contiene el gen de la proteina Wnt3a humana que presenta una elevada eficacia de expresion de la proteina Wnt3a humana.

Antecedentes de la tecnica La proteina Wnt es una glicoproteina secretora que tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 y que es conocida por ser una importante molecula de senalizacion intercelular para la morfogenesis embrionaria y la regeneracion del foliculo piloso, y esta implicada en la diferenciacion y el mantenimiento funcional de los melanocitos. Se conocen casi 20 tipos de Wnt de vertebrado, estas Wnt forman subfamilias, y cada una se une a un receptor de siete dominios transmembranales conocido como Frizzled y a unos receptores de un solo dominio transmembranal conocidos como LRP de la membrana celular. Basandose en estudios sobre trasplantes en ratones, se ha demostrado claramente que Wnt3a, que es un miembro de la familia de Wnt, mantiene la actividad de la papila pilosa en cuanto a la induccion de la formacion de foliculos pilosos al actuar sobre celulas de la papila pilosa [J. Kishimoto et al., Genes & Dev., 15 de mayo de 2000, 14 (10) , 1181-5], y, recientemente, se ha centrado una considerable atencion en su relacion con la induccion de foliculos pilosos. Se esta llevando a cabo una investigacion sobre la proteina Wnt3a recombinante aviar o de raton, producida por Wnt3a aviar o por celulas aviares transformadas con el gen Wnt3a de raton, dejando que esta proteina recombinante actue sobre celulas de papila pilosa de raton.

Cuando se tiene en cuenta un uso en estudios clinicos aplicables a seres humanos, es necesario preparar grandes cantidades de proteina recombinante Wnt3a humana en lugar de proteina humana o de raton. Sin embargo, la Wnt3a humana recombinante presenta el problema de que es dificil producir una proteina que conserve una actividad adecuada, probablemente a causa de problemas en la traduccion y la modificacion despues de la transcripcion. Por lo tanto, la seleccion de celulas huesped para uso en la produccion eficaz de una proteina recombinante Wnt3a humana que conserve la actividad de induccion de foliculos pilosos es un factor importante para elucidar los mecanismos de la formacion y regeneracion de foliculos pilosos, asi como para explorar y evaluar farmacos que induzcan y aceleren la formacion y regeneracion de foliculos pilosos.

Documento 1 que no es Patente: Genes & Dev., 15 de mayo de 2000, 14 (10) , 1181-5.

Descripcion de la invencion Problemas a resolver por la invencion Un objeto de la presente invencion es proporcionar una celula capaz de expresar eficazmente una proteina recombinante Wnt3a humana que tenga una actividad que induzca la formacion de foliculos pilosos por celulas de papilas pilosas.

Medios para resolver los problemas Como resultado de la realizacion de vastos estudios, los inventores de la presente invencion hallaron que celulas procedentes de foliculos pilosos y celulas procedentes de cancer de prostata son optimas como huespedes para la expresion eficaz de una proteina recombinante Wnt3a humana que conserve la actividad, lo que condujo a la complecion de la presente invencion.

Por lo tanto, la presente solicitud incluye las invenciones siguientes:

(1) una celula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano, en donde la celula es seleccionada de un grupo que consiste en celulas procedentes de foliculos pilosos y celulas procedentes de cancer de prostata, en donde las celulas procedentes de foliculos pilosos son celulas IORS o IDP, y en donde las celulas procedentes de cancer de prostata son celulas PC3; y

(2) la celula de (1) , en donde el vector es un vector pTarget.

Efectos de la invencion De acuerdo con la presente invencion, se puede expresar eficazmente una proteina recombinante Wnt3a humana que tenga una actividad que induzca la formacion de foliculos pilosos por celulas de papilas pilosas y se espera que se lleve eficazmente a cabo la elucidacion de los mecanismos de la formacion y regeneracion de foliculos pilosos, asi como la evaluacion de farmacos eficaces para la regeneracion de foliculos pilosos.

Breve descripcion de los dibujos La Figura 1 muestra la secuencia de nucleotidos de un gen que codificaWnt3a.

La Figura 2 muestra una transferencia Western de celulas que contienenWnt3a.

La Figura 3 muestra la confirmacion de la expresion funcional de Wnt3a introducida por expresion acelerada de Lef

1.

Mejor modo de llevar la invencion a cabo La Wnt3a humana es una proteina compuesta de 352 restos de aminoacido y, en la ID. SEC. n° 1 y la Figura 1, se muestra la secuencia de nucleotidos de un gen que codifica esta proteina. Se puede producir un vector de expresion que contenga el gen Wnt3a uniendo el gen Wnt3a a un vector por medio de un sitio de restriccion adecuado que se va a poner bajo el control de un promotor adecuado del vector usando un metodo conocido. No hay limitaciones particulares al tipo de vector y se pueden utilizar todos los tipos de vectores comercialmente asequibles, incluyendo vectores de expresion de celulas animales comercialmente disponibles tales como el vector pTarget (Promega) , el vector pBK-CMV o el vector pBK-RSV (Stratagene) . Es particularmente preferible el vector pTarget.

No hay limitaciones particulares a un promotor preferible utilizado en la presente invencion con tal de que sea un promotor adecuado que corresponda al huesped usado para que se exprese el gen, ejemplos del cual incluyen el promotor de CMV, el promotor de SRa, el promotor de SV40, el promotor de LTR, el promotor de HSV-TK y el promotor de º-actina.

Ademas, en el vector de expresion tambien pueden estar contenidos, segun se desee, un potenciador, una senal de corte y empalme, una senal de adicion de poli (A) , un marcador de seleccion o un origen de replicacion de SV40 y similares.

Como celulas huesped se utilizan celulas procedentes de foliculos pilosos, tales como celulas inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS; del ingles, inmortalized outer root sheath) humanas o celulas inmortalizadas de papila dermica (IDP; del ingles, inmortalized dermal papilla) humanas, o celulas procedentes de cancer de prostata humano (PC3) . Son particularmente preferibles las celulas IORS.

Para obtener celulas humanas de vaina radicular externa, se obtiene cuero cabelludo humano como un subproducto de, por ejemplo, procedimientos de cirugia plastica o procedimientos de cirugia, y se obtiene tejido de foliculo piloso del cuero cabelludo bajo un microscopio estereoscopico. A continuacion, despues del tratamiento del tejido de foliculo piloso con una disolucion de hidrolasa, tal como una disolucion mixta de colagenasa y dispasa, durante 30 minutos a 37 aC, se deja reposar el tejido en una placa de cultivo revestida con colageno, lo que va seguido de un cultivo en un medio exento de suero y de bajo contenido en calcio, tal como K-GM (Clonetics) o Keratinocyte-SFM (Gibco BRL) , y de sustitucion del medio cada 2 semanas. Una vez que se ha confirmado que las celulas han proliferado, se liberan las celulas adheridas al recipiente de cultivo y se recuperan por centrifugacion, lo que va seguido de un subcultivo en medio exento de suero.

Las celulas humanas de papila dermica se obtienen tambien de la misma manera que las celulas de vaina radicular externa a partir de cuero cabelludo humano obtenido como subproducto de procedimientos de cirugia plastica y procedimientos de cirugia, bajo un microscopio estereoscopico. A continuacion, se cultivan las papilas pilosas en un medio de cultivo ordinario para celulas animales, tal como Dulbecco's Modified Eagle Medium que contiene suero de ternera fetal, y se sustituye el medio cada 2 dias. Una vez que se ha confirmado que las celulas han proliferado, se liberan las celulas adheridas al recipiente de cultivo y se recuperan por centrifugacion, lo que va seguido de un subcultivo en medio exento de suero.

La inmortalizacion de celulas humanas de vaina radicular externa o celulas humanas de papila dermica obtenidas de esta manera puede ser llevada a cabo mediante metodos conocidos. Preferiblemente, se puede utilizar el gen del antigeno T grande del virus SV40, deficiente en cuanto a un origen de replicacion, como se describe en la Publicacion Japonesa de Patente no Examinada n° 2000-89. Este gen se utiliza normalmente en un estado que se introduce en un vector de plasmido o virus. Este gen se utiliza ampliamente en la tecnica como un gen tipico para inmortalizar celulas animales y se puede adquirir facilmente. Por ejemplo, en Doren et al., Mol. Cell. Biol., 1653-1656 (1984) , se describe un virus en que la region EIA del vector adenovirico, LEI/X [Doren et al., J. Virol., Volumen... [Seguir leyendo]

1. Una celula transformada con un vector que contiene el gen Wnt3a humano, en donde dicha celula es seleccionada de un grupo que consiste en celulas procedentes de foliculos pilosos, en donde dichas celulas procedentes de foliculos pilosos son celulas inmortalizadas de vaina radicular externa (IORS) o celulas inmortalizadas de papila dermica (IDP) , y celulas procedentes de cancer de prostata que son celulas de cancer de prostata humano (PC3) .

2. La celula segun la Reivindicacion 1, en donde el vector es un vector pTarget.